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体外合成的circRNA可以用于肿瘤治疗?
来源: | 作者:geneseed | 发布时间: 2018-09-27 | 459 次浏览 | 分享到:

 

    miRNAs通过直接碱基互补配对结合或者剪切mRNAs转录后调控基因的表达从而不同肿瘤类型中经常发挥着至关重要的作用。如果能够寻求一些方法,抑制miRNAs功能那么对于肿瘤治疗会有很大的帮助。已有研究报道,通过人工合成线性miR-9 sponge,抑制miR-9的表达和功能,从而抑制高度恶性乳腺癌转移;线性miR-135b sponge抑制miR-135b ,进而抑制肿瘤的生长、侵袭和转移。但是目前还没有研究人员利用人工合成的环形RNAs抑制miRNA治疗肿瘤的案例

 

     由于天然circRNAs具有抵抗外切酶消化结合不同miRNAs后调节其功能的两大特性,来自美国约翰霍普金斯大学的Stephen J. Meltzer教授团队在体外合成可以结合miR-21circRNA——scRNA21,发现其可以耐受核酸酶的降解,上调原本miR-21靶向抑制的肿瘤抑制基因DAXX的表达,从而明显抑制高表达miR-21胃癌细胞的增殖该研究揭示了体外合成circRNAs sponge作为抑制miRNA功能的快速、方便和有效的策略,同时也将可能应用于胃癌患者的肿瘤治疗

 

1. TCGA数据库筛选与胃癌患者高度相关的miRNA,以作为circRNA的靶标

作者首先利用TCGA肿瘤数据库,挖掘到相比于正常人,胃癌患者中137circRNAs表达上调,48circRNAs表达下调,其中miR-21表达水平上调程度较大,约为1.76倍。同时体外通过qRT-PCR验证了相比于正常胃上皮细胞HFE145,胃癌细胞株NCI-N87AGS MKN28KATOIIImiR-21表达水平明显上调,后续实验将采用miR-21表达相对较高的NCI-N87AGS MKN28细胞作为体外实验的细胞。

 

2. 体外设计合成针对miR-21circRNA sponge ——scRNA21 

设计合成scRNA21的流程:首先设计含有5个重复的凸起的miR-21结合位点的线性scRNA21overlap PCR后扩增为双链DNA,克隆连接到含有T7启动子的TOPO质粒载体上,利用T7 RNA聚合酶生成短RNA,小牛肠磷酸酶使RNA转录物的5'末端去磷酸化,并且T4多核苷酸激酶(在ATP存在情况下)产生适连接的RNA分子T4 RNA连接酶孵育促使RNA环化,即形成scRNA21

 

 

 

3. 验证体外合成的scRNA21

RT-PCR实验通过反向引物可以从scRNA21扩增出约为100 nt的条带,而线性RNA则无法扩增出这样的条带(A)。同时Sanger测序这大小为100 nt的产物,证实了scRNA21头尾连接位点的存在(B)。另外Sanger测序证实了反向引物扩增scRNA21后的产物存在5个重复的凸起的miR-21结合位点(黄色标记)(C)。

 

4. 检验scRNA21FBSRNase R的耐受程度

线性LRNA213% FBS中开始出现降解,在4% FBS中降解92%;而环状scRNA21相对位点,只有在7% FBS中才出现明显的降解(A)。在不同浓度的RNase R处理下,scRNA21明显抵抗RNase R的消化(B)。

 

 

5. 体外合成scRNA21的功能验证

在高表达miR-213个胃癌细胞株NCI-N87, AGSMKN28中,转染含有或者不含有miR-21结合位点的荧光素酶报告基因质粒后,含有miR-21结合位点的质粒的相对荧光强度明显降低,基因表达受抑制,而当给予miR-21抑制剂或者scRNA21处理后,质粒的相对荧光强度明显恢复上调,提示scRNA21可充当miR-21抑制剂,发挥结合miR-21的功能,从而抑制miR-21的下游效应(A)。

    由于miR-21高表达可以促进胃癌细胞的增殖,通过WST-1检测细胞增殖实验,发现miR-21抑制剂或者scRNA21处理可以明显抑制三种胃癌细胞的增殖(B)。

 

    同时通过免疫荧光和共聚焦观察实验,发现在三种胃癌细胞中转染scRNA21后,细胞中的凋亡相关蛋白——剪切型caspase-3 的表达水平明显升高,提示scRNA21可以明显诱导胃癌细胞的凋亡(A-F)。

 

6. 筛选scRNA21结合miR-21后影响到的下游蛋白

既然致癌miRNA靶向结合mRNA后改变其下游蛋白的表达,那么scRNA21作为miR-21sponge,很有可能会影响其下游蛋白的表达。作者转染scRNA21到细胞后,利用TMT标记蛋白进行全蛋白组分析了6341种蛋白,筛选miR-21直接结合的235种蛋白,其中19种蛋白的差异表达比较明显。相比于blanknscRNA组,scRNA21组会上调原本被miR-21下调表达的蛋白(A-C)。

 

 

 

接着在COSMIC数据库验证这19种蛋白,发现只有肿瘤抑制蛋白DAXX出现在COSMIC数据库中,同时体外WB实验证实了scRNA21处理胃癌细胞8h后,肿瘤抑制蛋白DAXX表达水平明显上调,这提示了scRNA21可以恢复原本被miR-21抑制的肿瘤抑制蛋白的表达。

 

 

 

 

 

参考文献

1. Liu X, et al. Synthetic circular RNA functions as a miR-21 sponge to suppress gastric carcinoma cell proliferation. Molecular Therapy: Nucleic Acid. 2018. Doi: 10.1016/j.omtn.2018.09.010