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Aβ circRNA与阿尔茨海默病
来源: | 作者:geneseed | 发布时间: 2018-10-09 | 465 次浏览 | 分享到:


        阿尔茨海默病AD)是一种与进行性记忆、思维和行为能力丧失相关的最常见的痴呆病。AD作为一种与衰老相关的神经退行性疾病,其已知最大的危险因素是增长的年龄。大量研究都认为淀粉样β肽()累积和tau蛋白过度磷酸化导致AD。据报道,参与APP蛋白水解过程的APP基因突变会加速了肽的积累。肽聚合成有毒的寡聚体并聚集成不溶性淀粉样斑块,并通过GSK3β活化引起tau蛋白过度磷酸化,随后在神经元内形成的神经原纤维缠结引发了一系列事件,最终导致神经元死亡。这种阿尔茨海默病被称为家族性阿尔茨海默病(fAD)。由于它在较早的年龄发展,也被描述为早发性家族性阿尔茨海默病(EFAD),但这种类型的AD占所有AD患者的比例低于1-5%。

其实,最常见的AD形式是迟发性阿尔茨海默氏症(LOAD),通常出现在65岁及以上的人群中。由于这种类型AD的遗传原因尚不清楚,所以它通常被称为散发性ADsAD)。

尽管fADsAD之间存在差异,但它们具有共同的症状,导致脑损伤逐渐增加。 fADsAD的病理学标志分别是由积聚和tau过度磷酸化引起的斑块和缠结。 LOAD发展和进展的确切机制还未明确,此外, LOAD积累的机制也是不清楚的

环状RNAcircRNA)是进化保守的转录物,其通过5'3'末端反向剪接从前mRNA衍生而来。circRNA在神经元中表达丰富。有趣的是,circRNAs在多种生物的衰老过程中受到调节,这表明circRNAs在脑老化和与衰老相关的神经退行性疾病中发挥着潜在的作用

 

      来自德国马克斯普朗克衰老生物学研究所的研究者于biorxiv网站在线发表的题为The role of Aβ circRNA in Alzheimer’s disease: alternative mechanism of Aβ biogenesis from Aβ circRNA translation”的研究,发现了阿尔茨海默病发病过程中Aβ circRNA可以形成Aβ肽的新机制,同时也揭示了circRNA可以翻译蛋白,这一重要功能对于生理或者病理过程的重要作用。(PS:该研究是研究人员的新发现,暂时未发表于任何正式杂志,原文需到biorxiv网站下载)

 

 

作者对两种可能形成的机制进行总结:左边是已有大量研究对家族性AD肽形成机制的描述;右边则是本文发现的Aβ circRNA-a形成肽的新机制具体描述。

 

1. 通过深度测序数据分析APP基因来源的circRNAs

通过已有研究中的深度测序数据进行分析,挖掘到了人淀粉样前体蛋白APP基因来源的几种circRNAs,其中一种包含ORFcircRNAhsa_circ_0007556)。利用反向引物RT-PCR人脑样本来源的总RNA,电泳结果发现扩增产物中存在多种不同长度的APP基因来源的几种circRNAsA)。同时对PCR扩增产物再次进行深度测序分析,发现了16circRNAshsa_circ_0007556Aβ circRNA-a也包括在其中;对RNase R处理后的人脑组织来源的总RNA也经过上述相同处理,也可以发现这16circRNAs中有15种是一样的,另外也发现了一种新的circRNAtable 1)。

在这些circRNAs中,Aβ circRNA-a含量最丰富,因此被选为后续Aβ circRNA功能研究的主要靶点,其RT-PCR扩增产物被克隆进入pCMV-MIR载体进行体外过表达后的功能验证。

 

 

 

 

2. 体内证实Aβ circRNA-a的存在并构建过表达载体进行研究

利用特异性引物对人脑额叶和海马组织来源的总RNA进行RT-PCR检测,明确了Aβ circRNA-a存在于人脑组织中(AC);为进一步探索Aβ circRNA的功能,作者通过内含子介导增强circRNA体外表达策略(后续会分享这种方法),体外构建了pCircRNA-BE-Aβ-a  pCircRNA-DMo-Aβ-a过表达载体(B),转染至HEK293后,RT-PCR检测发现其表达量分别增加了21853268(D,剪切位点序列与野生型Aβ circRNA-a一致,电泳明确了Aβ circRNA-a载体的过表达情况(C)Sanger测序证明体外这种过表达的Aβ circRNA-a与天然产物的序列一致,Northern印迹实验也证明了Aβ circRNA-a体外过表达成功,RNase R处理证明其对该酶的耐受性,最重要的是,这两种过表达载体只会产生Aβ circRNA-a,而不会产生成熟线性RNA,造成产物污染,以保证后续功能验证的有效性;另外Aβ circRNA-a体外过表达并不会影响HEK293细胞内源性APP mRNA的表达。


 

 

 

3. 体外过表达Aβ circRNA-a具有蛋白翻译功能

由于之前有研究报道某些circRNAs能被翻译成蛋白,而Aβ circRNA-a中包含基因ORF序列,所以作者通过构建载体于体外过表达Aβ circRNA-a后,WB检测到细胞中肽的表达条带约为15-20kDa,产物被称为Aβ circRNA-a-DP,其中在HEK293细胞可检测到Aβ circRNA-a的本底表达,而pCircRNA-DMo-Aβ-a载体过表达效率最高。有趣的是,作者发现Aβ circRNA-a的表达差异大,而其对应的Aβ circRNA-a-DP蛋白翻译水平差异不一定打, 说明存在未知的调控机制在调控circRNA的蛋白翻译。

 

4. Aβ circRNA-a可以形成Aβ circRNA-a-DP,最后形成肽?

Aβ circRNA-a可以被翻译成Aβ circRNA-a-DP蛋白,其序列中含有β和 γ-分泌酶剪切位点,提示Aβ circRNA-a-DP很有可能经过β和 γ-分泌酶蛋白水解过程形成肽。通过IP-WB实验检测到Aβ circRNA-a过表达的HEK293细胞上清中存在肽,其肽表达差异水平与Aβ circRNA-a-DP蛋白水平差异趋势几乎一致,说明表达上调的肽很有可能来自Aβ circRNA-a-DP

 

5.  Aβ circRNA-a形成Aβ肽,那么肽最终会形成Aβ斑块?

肽形成Aβ斑块是AD疾病的标志,既然Aβ circRNA-a可以形成Aβ肽,那么这Aβ肽是否可以形成Aβ斑块。作者通过体外电转染pCircDNA-DMo-Aβ-a质粒到小鼠胚胎神经元培养10天后,IF检测到相比于对照质粒组,pCircDNA-DMo-Aβ-a转染组的神经元出现Aβ斑块信号(红色荧光),绿色荧光为神经元,这提示在原代神经元中过表达Aβ circRNA-a可以形成Aβ斑块。

 

6. Aβ circRNA-a过表达后形成的肽,对下游信号通路的影响?

HEK293细胞中转染两种载体后过表达Aβ circRNA-aWB检测发现其都能明显增强GSK3β蛋白、Tau蛋白和磷酸化Tau蛋白的表达水平,其中pCircRNA-DMo-Aβ circRNA-a质粒过表达后促进相关蛋白表达效率相比高点,提示过表达Aβ circRNA-a可以明显上调GSK3β蛋白表达和增强tau蛋白磷酸化。

 

 

 

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原文链接:https://www.biorxiv.org/content/early/2018/09/05/260968