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HCC致癌因子HNF4调控circRNA_104075表达,促进HCC发生
来源: | 作者:geneseed | 发布时间: 2018-11-06 | 136 次浏览 | 分享到:

 

原发性肝癌是全球癌症相关死亡的第三大常见原因。肝细胞癌(HCC)是最常见的原发性肝脏癌症。由于缺乏高特异性和敏感性的早期诊断生物标志物, HCC患者通常得不到及时的治疗。用于临床诊断的经典生物标志物包括α-胎蛋白(AFP),α-胎蛋白-L3AFP-L3)和脱羧基凝血酶原(DCP)。 然而,这些生物标志物会造成一些HCC患者假阳性和假阴性的诊断结果。因此,用于HCC患者诊断的新诊断生物标志物仍然是迫切需要的。

由于大多数基于蛋白实验的诊断缺乏预期的精确性,所以考虑非编码RNA作为诊断HCC的生物标志物。据报道,长链非编码RNA——UCA1可作为用于诊断HCC的标志物,其敏感性高达90%,特异性高达82%。还有长链非编码RNA ——HULC9DANCR10linc0122511和一些microRNA——miR21被报道具有作为诊断HCC的生物标志物的潜能。相比于长链非编码RNAmiRNAcircRNA作为一种新型环状RNA,具有共价闭合环状结构,在组织和血液中高度稳定表达和存在。例如,circRNA_10720海绵吸附靶向vimentinmiRNA,促进EMT进程和促进HCC发生发展;circRNA_ 0016788海绵吸附miR-486,促进CDK4的表达,从而促进HCC肿瘤形成。本文作者也发现了一种circRNA_104075与肿瘤HCC的发生有着密切的关系,下面将解读一下作者的研究思路。

 

来自上海交通大学附属胸科医院于永春的研究团队于Cell Death Dis杂志在线发表了题为“circRNA_104075 stimulates YAP-dependent tumorigenesis through the regulation of HNF4a and may serve as a diagnostic marker in hepatocellular carcinoma”,介绍了在肝细胞癌HCC患者血清和组织、HCC细胞系中高表达的circRNA_104075,其表达受HNF4a调控,circRNA_104075海绵吸附靶向抑制YAP表达的miR-582-3p,促进肝癌的发生和进展,也揭示了circ_104075在诊断HCC方面具有高达96%的敏感性和98.3%特异性,具有作为诊断HCC的生物标志物的潜能,且优于经典标志物AFP, DCPAFP-L3

 

1. circ_104075HCC组织中高表达

作者首先对之前三个研究者发表的HCC组织circRNA芯片表达结果进行交叉和汇总分析,挖掘到三个芯片结果中都出现高表达的circRNAcirc_104075,故后续对circ_104075进一步分析。在10HCC和癌旁正常组织、HCC细胞系中验证了circ_104075高表达的情况;相比于之前研究报道的诊断HCC的血清生物标志物DANCR, HULC, UCA1, miR-21 miR-223HCC患者中circ_104075表达上调的水平偏高点。

 

2. HNF4a可以正向调控circ_104075的表达水平

通过过表达和敲低HCC致癌转录因子的表达后,发现HNF4a的表达与circ_104075的表达成正相关;相比于正常小鼠,HNF4a-/-小鼠肝的大小和重量明显减少,同时circ_104075的表达也明显降低;临床HCC组织分析发现HCC患者中HNF4a的表达水平也是明显上调,进一步证实了HNF4a的表达与circ_104075的表达成正相关的结论。

 

 

 

3. HNF4a调控circ_104075的机制?

通过JASPAR数据库确定了HNF4a可以结合circ_104075启动子(1409 to1401)的位点;接着利用ChIP-qPCR捕获HNF4a沉淀复合物后,在HCC组织和HCC细胞系中都发现了HNF4a可以结合circ_104075启动子(1482 to 1296)的位点;荧光素酶报告基因实验也证实了过表达HNF4a可以明显促进circ_104075启动子的荧光素酶活性,而敲低HNF4a表达抑制circ_104075启动子的荧光素酶活性;如果突变circ_104075启动子上HNF4a结合位点,过表达或者敲低HNF4a表达则对其荧光素酶活性无明显影响,提示HNF4a结合circ_104075启动子,正向调控其表达。

 

 

 

4. circ_104075促进致癌信号通路YAP表达

YAP可以被Hippo通路中的激酶——LATS磷酸化和抑制。 当YAP被其他刺激物,如O-GlcNAcylation激活时,它与LATS的结合解开,从细胞质转移到细胞核,与其依赖的转录因子,如TEADRUNX1相互作用。 YAP是众所周知的会促进HCC的因子,在大约62%的肝癌组织中表达上调。 YAP转基因过表达导致器官大小失调和最终发生HCC的结果。通过过表达和敲低circ_104075表达后,在两种肝癌细胞中RT-qPCRWestern blotting检测促进HCC的相关信号通路的改变,发现只有YAPcirc_104075的表达呈现正相关;临床HCC组织分析YAP的表达,也同样证实了YAP表达与circ_104075的表达成正相关的结论。

 

 

 

5. circ_104075可结合miR-582-3p发挥功能?

由于circRNA最常见的功能是作为ceRNA吸附miRNA,直接调控靶蛋白的表达,作者利用miRanda数据库预测了circ_104075最有可能结合的miRNAmiR-582-3p, miR-195-3p, miR-3916, miR-548u miR-4744五种,接着利用circ_104075探针捕获复合物后RT-qPCR检测发现只有miR-582-3p的结合;通过构建突变形式circ_104075miR-582-3p,荧光素酶报告基因实验证实了WT circ_104075WT miR-582-3p的结合WT miR-582-3p可以抑制WTMut1Mut2 circ_104075的酶活性,而抑制不了Mut3 circ_104075的酶活性,提示circ_104075该结合位点的5’3’端序列对于miR-582-3p的结合至关重要。同时Mut miR-582-3p则无法抑制circ_104075的酶活性。

 

 

6. miR-582-3p可以靶向结合YAP-3′UTR

既然证实了circ_104075可以miR-582-3p,而circ_104075YAP表达成正相关,那么miR-582-3p是否靶向调控YAP表达?体外WB结果证实了miR-582-3p表达与YAP表达的负相关性, 通过TargetScan预测了miR-582-3p5’端可以结合YAP mRNA 3′UTR的三个位点,对这三个位点进行突变后进行荧光素酶报告基因实验,发现miR-582-3p无法抑制Mut1-YAP-3′UTR,说明YAP mRNA 3′UTR315-321区域)对于miR-582-3p5’端的结合很重要,后续会对该结合区域进一步研究;通过敲低circ_104075后抑制miR-582-3p,证明了miR-582-3pcirc_104075促进YAP表达过程中发挥着重要作用。

 

7. YAP-3′UTRm6A修饰水平促进miR-582-3p的结合

由于m6A修饰在调节mRNA稳定性过程中发挥着重要作用,但是m6A修饰是否会影响到miRNAmRNA的相互结合。利用m6A抗体捕获复合物后RNA-IP-qPCR检测到了P1-YAP-3′ UTR (235–419 区域)的表达上调,而该区域对于miR-582-3p的结合也很重要。YAP-3′UTR 235-419区域)中的353–357区域存在m6A motifRRACU——AGACU,通过突变这位点碱基后过表达进行RNA-IP-qPCR,发现只有不突变最后三个碱基ACUYAP-3′UTRm6A修饰水平不会降低。同时荧光素酶报告基因实验也证实了YAP-3′ UTR 353–357区域的AGACU对于miR-582-3p结合后发挥抑制功能来说是至关重要的。临床组织样本的RNA-IP-qPCR也证实了HCC患者组织的YAP-3′ UTR 353–357区域m6A修饰水平明显降低,与HCC患者的YAP表达上调有一致性。

 

8. circ_104075HCC临床诊断的意义

对不同肿瘤患者血清的circ_104075表达水平分析,表明circ_104075HCC患者血清中高表达是具有特异性的,与HCC临床分期有一定正相关性,同时手术治疗后HCC患者血清中的circ_104075表达水平明显降低;AUC-ROC曲线分析,相比于HCC经典生物标志物DNACR, HULC, miR-223, miR-21UCA1,血清circ_104075表达水平具有更高的敏感性和特异性,提示其可作为诊断HCC的生物标志物的临床应用潜能。

 

本文亮点:

1. 通过三个芯片分析结果获得HCC肿瘤高表达的circRNA_104075

2. HCC致癌因子HNF4a可以正向调控circRNA_104075,促进HCC的发生的新机制;

3. circRNA_104075海绵吸附miR-582-3p,促进YAP的表达;

4. YAP 3′UTR 353–357区域AGACU位点的m6A修饰水平对于miR-582-3p的结合和发挥抑制YAP表达的功能是非常重要的。

 

参考文献

1. Zhang X, et al. circRNA_104075 stimulates YAP-dependent tumorigenesis through the regulation of HNF4a and may serve as a diagnostic marker in hepatocellular carcinoma. Cell Death Dis. 2018 Oct 25;9(11):1091. doi: 10.1038/s41419-018-1132-6.