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circFAT1(e2) 作为胃癌发生的抑制分子
来源: | 作者:geneseed | 发布时间: 2018-11-22 | 140 次浏览 | 分享到:

 


来自苏州大学第一附属医院高凌的研究团队最近于Cancer Letters (IF=6.491)发表了一篇题为“A novel circular RNA, circFAT1(e2), inhibits gastric cancer progression by


targeting miR-548g in the cytoplasm and interacting with YBX1 in the nucleus”的研究,首次发现了新型circFAT1(e2)作为胃癌发生的肿瘤抑制因子,circFAT1(e2)在胃癌细胞的胞浆和胞核均有分布,处于胞浆的circFAT1(e2)可以sponge miR-548g,上调RUNX1的表达,从而抑制胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭;处于胞核的circFAT1(e2)直接结合YBX1,下调YBX1的表达,抑制胃癌的发生发展。

 

1. 挖掘胃癌相关的新型circRNA

通过GEO数据库检索关键字后,随机挑选了两个数据集(GSE100170 GSE83521),两个数据集都有前250名表达差异明显的circRNA,其中只有两circRNA(hsa_circ_0067997 hsa-circ_0001461)是在两个数据集中同时表达下调的,RT-PCR检测只有hsa_circ_0001461在胃癌细胞株中均有表达,则选择其为后续研究的对象。因为hsa_circ_0001461来源于FAT1基因的2号外显子,故命名为circFAT1(e2)。体外RT-PCR证明了只有在利用反向引物PCR该基因的cDNA时检测到circFAT1(e2)Sanger测序也证明了其来源于基因的2号外显子;FISH实验证明了circFAT1(e2)位于胞浆和胞核;放线菌素DRNase R处理证明了其属于环状结构,不同于线性mRNA

 

2. circFAT1(e2)的表达水平与临床胃癌的相关性

相比于正常组织,胃癌组织中circFAT1(e2)的表达水平明显下调,而且相比于不发生转移的胃癌组织,发生转移的胃癌组织中circFAT1(e2)的表达水平明显下调;相比于正常为组织细胞,六种胃癌细胞株中circFAT1(e2)的表达水平也明显下调;FISH实验也证明了同样的结果;临床数据分析显示,circFAT1(e2)的表达水平与性别和年龄无关,而与pNpM状态和临床分期有关。

 

 

3. 过表达circFAT1(e2)抑制胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭

构建circFAT1(e2)过表达载体,转染到胃癌细胞MGC-803 MKN-28中,验证其过表达情况;MTT实验证明过表达circFAT1(e2)可以明显抑制细胞的增殖;克隆形成实验证明过表达circFAT1(e2)可以明显抑制细胞克隆团形成的数目transwell实验证明过表达circFAT1(e2)可以明显抑制细胞的迁移和侵袭能力。体内成瘤实验证明过表达circFAT1(e2)的胃癌细胞体内成瘤能力明显下降。

 

 

 

4.  胞浆的circFAT1(e2)直接结合miR-548g,上调RUNX1的表达

RT-PCRFISH实验证明circFAT1(e2)55%定位于胞浆,45%定位于胞核;很多时候定位在胞浆的circRNA通过靶向miRNA发挥其功能,作者通过TargetScan预测了miR-548gcircFAT1(e2)5个结合位点;荧光素酶报告基因实验证明了两者确实存在结合作用,而miR-548g抑制剂可以抑制这种结合作用;RIP实验利用miR-548g特异性探针也可以捕获到circFAT1(e2),而且miR-548g探针只能结合胞浆的circFAT1(e2)为进一步明确circFAT1(e2) miR-548g的表达相关性,过表达circFAT1(e2)可以下调miR-548g的表达水平,而敲低circFAT1(e2)表达可以上调miR-548g的表达水平;同时在6种胃癌细胞株中也证实了circFAT1(e2) miR-548g表达的负相关性,这些结果提示circFAT1(e2) 可以负调控miR-548g的表达水平

 

5. miR-548g通过调控RUNX1促进胃癌发生

生物信息学分析显示miR-548gRUNX1 3’ UTR存在3个结合位点,荧光素酶报告基因实验证实了两者的相互结合作用;过表达circFAT1(e2)上调了细胞中RUNX1的表达水平,敲低circFAT1(e2)表达会下调了细胞中RUNX1的表达水平,而不会影响到RUNX23蛋白的表达水平。但是如果同时添加miR-548g mimics处理,circFAT1(e2)正向调控RUNX1表达的效应会被miR-548g所抑制,这提示circFAT1(e2)通过结合miR-548g,正向调控RUNX1的表达。另外,过表达RUNX1诱导细胞增殖、迁移和侵袭能力下降的效应都会被miR-548g所抑制,这进一步说明miR-548g通过RUNX1促进胃癌细胞的致癌性。

 

6. 胞核的circFAT1(e2)直接结合YBX1 

由于之前的FISH结果显示circFAT1(e2)分布在胞核,为进一步研究其在胞核发挥的功能,作者利用在线catRAPID算法,预测了多种蛋白能与circFAT1(e2)结合,其中YBX1的结合评分最高。将circFAT1(e2)序列分为四部分(a, 1-1000; b, 1001-2000; c, 2001-3000; d, 3001-3283),利用算法预测每部分与YBX1的结合能力,其中ad部分的结合评分最高;RIP实验利用YBX1抗体捕获到了YBX1circFAT1(e2)的表达;通过体外合成circFAT1(e2)序列的四部分,用来检测pulldown YBX1的能力,同样证明了ad部分结合YBX1的能力最强。

 

7. circFAT1(e2)通过YBX1抑制胃癌细胞的致癌性

RT-PC实验发现过表达circFAT1(e2)可以明显下调YBX1的三种靶基因(EGFP, c-Met CDC25A)的表达,而YBX1可以抑制该效应;同时YBX1可以抑制过表达circFAT1(e2)后诱导细胞增殖、迁移和侵袭能力下降的效应,这提示circFAT1(e2)通过YBX1抑制胃癌细胞的增殖。

 

 

 

 

 

参考文献

1. Fang J, et al. A novel circular RNA, circFAT1(e2), inhibits gastric cancer progression by

targeting miR-548g in the cytoplasm and interacting with YBX1 in the nucleus. Cancer Lett. 2018 Nov 9;442:222-232. doi: 10.1016/j.canlet.2018.10.040.