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EIF4A3诱导的circMMP9促进胶质母细胞瘤的形成
来源: | 作者:geneseed | 发布时间: 2018-11-28 | 250 次浏览 | 分享到:

 

胶质母细胞瘤,也称为多形性胶质母细胞瘤(GBM),是从大脑开始的最具侵袭性的癌症。最初,胶质母细胞瘤患者的体征和症状是非特异性的,可能包括头痛,性格改变,恶心和类似于中风的症状,但是症状恶化通常很快,可能会进展到无意识状态。

大多数病例的原因尚不清楚,罕见的危险因素包括遗传性疾病,如神经纤维瘤病和Li-Fraumeni综合征,以及之前的放射治疗。胶质母细胞瘤占脑肿瘤15%,它们可以从正常脑细胞开始,也可以从现有的低级星形细胞瘤发展而来。目前的诊断通常通过CT扫描,MRI扫描和组织活检的组合来进行。目前没有明确的方法来预防这种疾病。通常的治疗手段涉及手术,之后使用化学疗法和放射疗法。药物替莫唑胺经常作为化疗的一部分使用。高剂量类固醇可用于帮助减轻肿胀和减少症状。

尽管经过了最大限度的诊断治疗后,但是患者常见的生存期只是1215个月,低于3%至5%的人存活超过5年。如果不进行治疗,生存期通常为三个月。这是脑膜瘤中最常见的癌症,也是脑膜瘤后第二常见的脑肿瘤。每年每10万人中就有3人患上这种疾病。它通常在64岁左右开始,在男性中比在女性中更常见。

 

这次分享一篇发表于Mol Cancer上的一篇题为“EIF4A3-induced circular RNA MMP9

(circMMP9) acts as a sponge of miR-124 and promotes glioblastoma multiforme cell tumorigenesis”的文章,该研究发现了真核起始因子eIF4A3诱导的circMMP9通过sponge miR-124,上调CDK4AURKA表达水平,促进多形性胶质母细胞瘤GBM的增殖、迁移和侵袭,促进胶质母细胞瘤的肿瘤形成。

 

 

1. circRNA芯片筛选差异表达的circMMP9

通过circRNA芯片表达分析,作者筛选出正常组织和GBM组织中表达差异最明显(表达上调)的circRNA——hsa_circ_0001162(circMMP9) ;生物信息学分析、PCR分析和Sanger测序结果显示,circMMP9MMP912号和13号外显子环化组成,分子大小约为328bp,而且不容易被RNase R降解,证明其属于环状RNART-qPCRFISH结果显示,GBM组织中circMMP9的表达水平明显上调;同时FISH实验证明circMMP9主要位于GBM细胞的胞浆中。

 

2. circMMP9GBM细胞增殖、迁移和侵袭的影响

由于在GBM细胞系中U251细胞高表达circMMP9,而U87细胞低表达circMMP9,所以后续对这两种细胞分别进行敲低和过表达实验,验证circMMP9的功能。构建circMMP9过表达质粒和针对splice junction位点设计好siRNA后,经过RNase R处理、RT-qPCR检测表达和FISH实验验证过表达和敲低circMMP9的效果符合预期;CCK-8和克隆形成实验证明过表达circMMP9明显增强细胞的增殖能力,而敲低circMMP9表达则抑制细胞的增殖能力;过表达circMMP9的细胞形态呈现出梭状、不规则和排列紊乱的情况,而敲低circMMP9的细胞形态呈现出单个、短梭状或者圆形的情况;Transwell实验证明过表达circMMP9促进细胞的迁移和侵袭能力,而敲低circMMP9则抑制该效应。

 

3. circMMP9直接靶向和sponge miR-124

由于circMMP9主要表达于胞浆之中,故作者猜测其在GBM中发挥作为miRNA sponge miRNA sponge的作用。对同样的GBM组织进行miRNA芯片分析差异表达的miRNA,其中hsa-miR-129-1-3p, hsa-miR-124-3phsa-miR-129-5p表达差异最明显,接着利用生物信息学分析发现,只有miR-124含有circMMP9的结合位点;过表达circMMP9可以抑制miR-124的表达,而敲低circMMP9表达会上调miR-124的表达水平;Pull-down结果和荧光素酶报告基因实验证明,miR-124circMMP9存在相互结合作用FISH实验证明miR-124circMMP9共定位于胞浆;RT-qPCRIHC实验发现GBM组织中miR-124的表达水平明显下调,与circMMP9的表达水平成负相关。

 

4. circMMP9通过miR-124促进GBM细胞的增殖、迁移和侵袭

为进一步明确miR-124对于circMMP9功能的影响,作者采用rescue实验证明circMMP9/miR-124轴对GBM细胞的增殖、迁移和侵袭能力的影响。CCK-8、克隆形成实验和transwell实验证明过表达circMMP9促进细胞增殖marker--PCNAKi67蛋白和EMT相关基因snailvimentin的表达,提高GBM细胞的增殖、迁移和侵袭能力,而miR-124则抑制该促进效应;敲低circMMP9表达会明显下调细胞PCNAKi67蛋白和EMT相关基因snailvimentin的表达,抑制GBM细胞的增殖、迁移和侵袭能力,而同时给予miR-124抑制剂可以逆转抑制效应。

 

 

5. circMMP9 通过miR-124上调 CDK4 AURKA的表达

接着作者探讨circMMP9/miR-124轴会影响哪些信号通路,从而调控GBM细胞的表型。结合对GBM组织的mRNA芯片分析和pubmed上已报道的miR-124靶向基因分析,挖掘到了miR-124的两个靶向基因是CDK4 AURKAWBIHC实验检测发现GBM组织中CDK4 AURKA的表达水平明显上调,而且与circMMP9的表达成正相关;同时在rescue实验中,WB结果证明circMMP9通过miR-124上调CDK4 AURKA的表达水平。

 

 

6. eIF4A3促进circMMP9的表达

通过circinteractome数据库,作者发现circMMP9 mRNA上游存在四个eIF4A3结合位点;RIP实验证明eIF4A3可以结合MMP9 mRNA和其上游abcd部分的序列,但不结合circMMP9e);体外构建5种包含eIF4A3结合位点的RNA转录本进行pull-down实验,证明越多的eIF4A3结合位点,越有利于eIF4A3 MMP9 mRNA的结合有趣的是,敲低eIF4A3表达明显抑制circMMP9的表达,而过表达eIF4A3表达明显促进circMMP9的表达,这提示eIF4A3可以结合MMP9 mRNA上游序列,促进1213号外显子的环化,促进circMMP9的表达。


 

7. 体内实验验证circMMP9的促肿瘤效应

过表达circMMP9U87细胞在小鼠体内成瘤能力明显增强,同时成瘤组织中CDK4 AURKA表达水平明显升高,而敲低circMMP9表达的U251细胞在小鼠体内成瘤能力明显降低,同时成瘤组织中CDK4 AURKA表达水平明显降低。

 

 

 

参考文献

1. Wang R, et al. EIF4A3-induced circular RNA MMP9 (circMMP9) acts as a sponge of miR-124 and promotes glioblastoma multiforme cell tumorigenesis. Mol Cancer. 2018 Nov 23;17(1):166. doi: 10.1186/s12943-018-0911-0.