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脂肪细胞分泌含有circ-DB的外泌体促进肝癌的发展和转移
来源: | 作者:geneseed | 发布时间: 2018-12-24 | 695 次浏览 | 分享到:

 

 

 

 

这次分享一篇由天津医科大学肿瘤医院的巴一教授研究团队在Oncogene杂志上在线发表的题为“Exosome circRNA secreted from adipocytes promotes the growth of hepatocellular carcinoma by targeting deubiquitination-related USP7”的研究,发现脂肪细胞分泌含有circ-DB的外泌体调控肝细胞癌HCC的去泛素化,促进细胞的增殖。临床上也发现体脂率高的HCC患者血浆外泌体中的circ-DB表达水平上调。机制上,外泌体circ-DB被肝癌细胞摄取后,抑制miR-34a表达水平,活化去泛素化相关的USP7/Cyclin A2信号通路,从而促进HCC的增殖和减少细胞DNA损伤

 

1. HCC患者中exo-circ-DBUSP7表达情况

分离HCC患者和正常人血浆外泌体后,进行电镜表型鉴定、WB鉴定特征性蛋白表达、颗粒直径分析。根据HCC患者的体脂率高低分为两组,对两组患者血浆中外泌体circRNAs表达分析,筛选出体脂率高的患者血浆外泌体circ-DB (circ-deubiquitination)的表达水平出现3倍左右的上调。Has_circ_0025129来源于12号染色体的TNFRSF1ATNFR1)基因。 据报道,USP7介导的NFkappaB的去泛素化对TLRTNFR诱导的基因表达是必需的,因此USP7可能在调节TNFR1信号通路和circ-DB的形成中起到正反馈的作用。临床上体脂率高的HCC患者组织中的USP7表达水平明显上调,外泌体circ-DBHCC组织中USP7表达成正比;将生物信息学分析,circ-DBmiR-34a可能存在相互结合,而USP7 mRNA上存在miR-34a结合位点,因此作者提出假设,脂肪细胞分泌含有circ-DB的外泌体被HCC摄取后,海绵并降低miR-34a表达,上调USP7的表达

 

2. exo-circ-DB, miR-34aUSP7三者的临床相关性

IHC结果显示体脂率高的HCC患者的癌旁组织和肿瘤组织中USP7表达都出现明显上调;USP7表达水平高的患者的存活率相对较低;相对体脂率偏高的患者,体脂率偏高的患者血浆外泌体中的circ-DB表达水平出现明显上调;而体脂率偏高的患者的HCC组织中的miR-34的表达水平明显降低,但是两组的USP7 mRNA水平无明显差异(提示可能影响其翻译后修饰);HCC组织中miR-34a的表达水平与exo-circ-DBUSP7的表达水平成负相关。

 

3. miR-34aUSP7之间是否存在相互作用?

经生物信息学预测,miR-34最有可能结合USP73′-UTR区域,miR-34a mimics上调miR-34a表达,而miR-34a 抑制剂可以抑制miR-34a表达;IP-qPCR实验证明miR-34a可以捕获和富集USP7 mRNA;荧光素酶报告基因实验进一步证明miR-34a可以结合USP7启动子,并调控其表达;WB实验证明上调miR-34a表达可以抑制USP7Cyclin A2的表达,而抑制miR-34a表达可以促进USP7Cyclin A2的表达;由于miRNAs一般会在翻译后水平负调控基因的表达,而USP7抑制Cyclin A2的泛素化降解,而不影响其mRNA水平。所以RT-qPCR结果显示miR-34a mimicsinhibitors没有影响到USP7Cyclin A2mRNA表达水平。而过表达或者敲低USP7的表达可以明显上调或者下调Cyclin A2的表达水平,提示miR-34直接抑制USP7表达,而USP7直接调控Cyclin A2的表达。

 

4. 脂肪细胞来源的外泌体到底对HCC细胞有什么效应?

3T3L1细胞来源的外泌体进行表型鉴定,发现相比于脂肪前体细胞或者其来源的外泌体,成熟脂肪细胞或者其来源的外泌体中的circ-DB表达水平明显上调;circ-DB表达敲低的3T3L1细胞来源的外泌体被称为3T3L1 exo circ-DB del3T3L1 exo处理HCC细胞可以明显抑制miR-34的表达,上调USP7Cyclin A2的表达水平,而3T3L1 exo circ-DB del处理HCC细胞可以明显上调miR-34的表达水平,下调USP7Cyclin A2的表达水平,提示携带exo-circ-DB的外泌体可以直接影响USP7 cyclin A2的表达

 

5. circ-DB miR-34a之间存在什么联系?

生物信息学分析预测,circ-DB miR-34a之间存在两个结合位点;luciferase reporter实验证实了circ-DB miR-34a的相互结合;敲低circ-DB表达明显促进miR-34a表达,而抑制USP7 cyclin A2的蛋白表达水平circ-DB过表达明显抑制miR-34a表达,而促进USP7 cyclin A2的蛋白表达水平,提示circ-DB可能作为miR-34asponge,发挥相应的功能

 

 

6. 脂肪细胞来源的外泌体对HCC细胞的生长有什么影响?

3T3L1 exo处理HCC细胞可以明显促进其增殖(Edu实验)和迁移(transwell实验),减少其DNA损伤(H2AFX染色);而3T3L1 exo circ-DB del处理HCC细胞后的效应则无明显的相应促进和降低效应。IF实验进一步证明,在HepG2细胞中分别过表达或者敲低circ-DB/USP7,相应地明显促进其增殖能力,减少DNA损伤情况,提示脂肪细胞来源的外泌体通过传递circ-DBHCC细胞中,促进HCC细胞的增殖和减少其DNA损伤

 

 

 

 

7. USP7介导下游靶点cyclin A2的去泛素化

IP实验证明,3T3L1 exo 处理HCC细胞,可以明显降低Cyclin A2 的泛素化,而3T3L1 exo circ-DB del处理对Cyclin A2 的去泛素化水平降低;分别过表达USP7或者 circ-DB,或者抑制miR-34a表达,可以明显降低Cyclin A2 的泛素化;而敲低USP7或者 circ-DB的表达,或者过表达miR-34a,则明显增强Cyclin A2 的泛素化,提示USP7作为一个致癌基因,可能通过抑制下游蛋白(包括cyclin A2)泛素化,维持相关基因的蛋白水平,促进肿瘤的发生发展

 

 

8. 体内实验验证circ-DB对于肿瘤生长的作用

构建circ-DB过表达和敲低的Hepa1-6细胞移植到小鼠体内,C57属于体脂率正常的小鼠,而ob/ob小鼠属于体脂率偏高的小鼠;ob/ob小鼠血清外泌体中的circ-DB表达水平明显上调,C57小鼠中的circ-DB过表达组小鼠血清外泌体和肿瘤组织的circ-DB表达水平明显上调,肿瘤体积相对偏大,促进肿瘤发生肝转移;ob/ob小鼠中的Hepa1-6组的circ-DB表达水平明显上调,促进肿瘤发生肝转移,而circ-DB敲低组只有在肿瘤组织的circ-DB表达水平明显下调,肿瘤体积相对偏小,抑制肿瘤发生肝转移,提示体脂率偏高的小鼠血清外泌体可以传递更多的circ-DBHCC细胞中,促进肿瘤生长和转移

 

 

9. 体内实验证明circ-DB/miR-34a/USP7通路对于HCC的作用

Hepa1-6细胞的体内成瘤实验的基础上,分析C57小鼠中circ-DB OE组和ob/ob小鼠中Hepa1-6组的肿瘤组织中miR-34a的表达水平明显降低,USP7Cyclin A2蛋白表达水平明显升高;而ob/ob小鼠中circ-DB KD组的肿瘤组织中miR-34a的表达水平明显升高,USP7Cyclin A2蛋白表达水平明显降低,提示了脂肪细胞来源外泌体circ-DB介导的miR-34a/USP7/Cyclin A2通路,可以促进HCC小鼠体内生长和转移

 

 

小结: 肝细胞癌是一种常见的肝疾病,其诱因包括慢性HBV/HCV感染、喝酒过多、免疫相关肝炎、肥胖。而肥胖是导致非酒精性肝炎的重要原因,作者在研究肥胖影响肝癌发生发展的机制过程中,结合了血浆外泌体、circRNAmiRNA等研究热点,是本文的一个亮点。本文的思路是很清晰和简单的,在体脂率高的HCC患者血浆外泌体中筛选到表达上调的circ-DB,结合已有的研究报道和生物信息学预测分析,发现circ-DB可以海绵结合miR-34a,上调其下游靶基因USP7的表达,导致USP7诱导下游癌基因相关的靶蛋白的去泛素化增强

,上调其中一个重要癌蛋白cyclin A2的表达,减轻HCCDNA损伤,促进HCC的增殖和迁移,容易导致HCC的肝转移发生。

 

参考文献

1. Zhang H, et al. Exosome circRNA secreted from adipocytes promotes the growth of hepatocellular carcinoma by targeting deubiquitination-related USP7. Oncogene. 2018 Dec 13. doi: 10.1038/s41388-018-0619-z.