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Circulation Research | circ_Lrp6调控VSMCs的功能
来源: | 作者:geneseed | 发布时间: 2019-01-02 | 585 次浏览 | 分享到:



 

 

来自意大利人文研究医院的研究人员最近在Circulation ResearchIF=15.211上在线发表了题为Circ_Lrp6, a Circular RNA Enriched in Vascular Smooth Muscle Cells, Acts as a Sponge Regulating miRNA-145 Function的研究,介绍了在血管平滑肌细胞(VSMCs)中低密度脂蛋白受体相关蛋白6Lrp6)来源的circ_Lrp6,作为miR-145的海绵,上调其靶基因ITGβ8, FASCIN, KLF4, Yes1Lox的表达;另外体内敲低circ_Lrp6表达,可以明显预防血管内膜增生,进而影响血管疾病的发病过程1

 

通过生物信息学方法筛选VSMCs circRNA

   作者对Hall IF等人研究2中的人VSMCs 转录组数据集进行深入DCC分析circRNAs种类,发现80% circRNAs是由编码蛋白的外显子组成的;为了了解小鼠和人VSMCs circRNAs 种类是否相似,RNA-seq分析了主动脉的平滑肌层组织,发现了小鼠VSMCs 来源的circRNAs的来源和组成与人VSMCs的分析结果相似。miR-145-5p, miR-143-3p,

miR-221-3p/222-3p, miR-21-5p, miR-29-3p, miR-26-5p, miR-133a-3p miR-1-3p都是一些已被报道在VSMCs中表达较高的miRNA,下一步则筛选出与这些miRNA有至少两个以上结合位点的circRNA,其中与miR-145-5p有至少7个结合位点的circ_Lrp6,在人和小鼠之间的保守性最高,提示其具有进化保守的生理功能。在结构上,circ_Lrp6来源于低密度脂蛋白受体相关蛋白6Lrp64,5,6,7号外显子。

 

 

circ_Lrp6的表达验证

RT-PCR检测发现利用针对剪切位点的反向引物只可以在cDNA模板上扩增出circ_Lrp6;在RNase R 和放线菌素D处理下,circ_Lrp6表达水平依然稳定;Sanger测序证实了circ_Lrp6的头尾剪切位点序列的存在,这些实验证明了circ_Lrp6的存在,且属于环状RNART-qPCR对小鼠不同组织和器官的表达分析,发现circ_Lrp6主要在脑、左心室和主动脉组织中高表达。原位杂交实验也证明了circ_Lrp6在冠状动脉、脑血管和主动脉中的高表达情况。

 

Circ_Lrp6可作为miR-145的海绵

    FISH实验和核浆成分分析实验证实了circ_Lrp6miR-145的共定位,主要位于胞浆之中;为了评估circ_Lrp6miR-145功能活性的影响,通过luciferase reporter实验证明只有WT circ_Lrp6可以逆转miR-145对靶基因Itgβ8 3UTR的转录活性的抑制效应。敲低circ_Lrp6表达明显抑制含有正常miR-145结合位点的Itgβ8 3UTR的转录活性,不会影响含有已被突变的miR-145结合位点的Itgβ8 3UTR的转录活性;在蛋白水平,WB实验证明了敲低circ_Lrp6表达可以明显抑制miR-145靶向的ITGβ8FASCINKLF4的蛋白表达。

 


 

 

Circ_Lrp6miR-145直接结合

    因为argonaute 2 (AGO2)一般可以介导circRNAsmiRNAs的结合。在过表达circ_Lrp6和三种miRNA的细胞中,进行AGO2的免疫沉淀实验,发现在miR-145过表达组的沉淀复合物中的circ_Lrp6表达水平最高;利用circ_Lrp6探针的免疫沉淀实验,证明了circ_Lrp6主要富集miR-145,而不是其他miRNAs。对每ugRNAncRNAs比例分析,发现miRNA-145/circ_Lrp6的比例约为31,符合circ_Lrp6作为miR-145 sponge的结论。原位杂交实验进一步直观地证明了60%VSMCs细胞中存在circ_Lrp6miR-145的共定位,而且85%的两者的共定位点是位于胞浆中miRNA调控mRNA降解的场所——P-bodiesSTED超分辨率显微成像也证明了circ_Lrp6miR-145的物理相互作用。

 

 

circ_Lrp6VSMCs的生理影响

    敲低circ_Lrp6表达抑制VSMC的迁移能力(划痕实验),降低细胞周期中S期的百分比,抑制细胞的增殖能力(cell number counting,还可以明显上调了VSMC分化标志物——Acta2 Sm22的表达水平。

 

Rescue实验证明circ_Lrp6miR-145的调控关系

    在敲低circ_Lrp6表达的VSMCs基础上抑制miR-145,可以逆转细胞增殖和迁移能力被抑制的效应,明显促进细胞的增殖,提高细胞的迁移能力,上调原本被miR-145靶向抑制的Fascin/lox/Yes1基因的表达,但抑制细胞分化标志物——Acta2 Sm22的表达。另外在gain of function实验中,过表达circ_Lrp6明显租金细胞的增殖和迁移能力,同时也促进被miR-145靶向抑制的Fascin/lox/Yes1基因的表达。

 

 

VSMCscirc_Lrp6 miR-145表达水平的相关性

   PDGF-BBTGF-β是两个非常重要的影响VSMC分化的细胞因子。给予两种细胞因子处理VSMC 24h后,细胞circ_Lrp6的表达水平都是下调的,而PDGF-BB抑制miR-145表达,TGF-β则促进miR-145表达,另外母系基因Lpr6的表达情况与circ_Lrp6的表达相似。为了解在病理条件下,circ_Lrp6 miR-145的表达水平是否会发生变化,缺氧处理VSMC可以明显下调miR-145的表达水平,而circ_Lrp6的表达水平无任何变化。

 

 


circ_Lrp6在血管疾病中发挥的作用

小鼠模型分析:作者采用了三种血管疾病的小鼠模型:ApoE-/-小鼠给予正常饮食(CD)和高胆固醇饮食(WD)用于构建高胆固醇血症导致动脉粥样硬化的模型;主动脉弓经主动脉狭窄导致压力过载性的心衰模型(TAC);腹主动脉到两个肾的血管被封闭其中一端后,发展为系统性慢性高血压的模型(IP)。动脉粥样硬化的小鼠模型的主动脉中miR-145表达明显下调,而circ_Lrp6表达水平无明显变化,可以是由于PDGF-BB和缺氧诱导信号通路导致两者的表达无明显相关性(A-B);在TAC模型的主动脉中miR-145表达也是明显下调,而circ_Lrp6表达水平无明显变化(C-D);而在系统性慢性高血压的模型中miR-145表达则明显上调(这可能与TGF-β信号通路参与高血压发生有关,与体外TGF-β处理后的结果一致),而circ_Lrp6表达水平无明显变化(E-F);

人类疾病模型分析:对患有动脉瘤的患者的腘动脉检测,发现miR-145表达也是明显下调,而circ_Lrp6表达水平无明显变化,与小鼠的结果有相似之处(G-H)。为了更直接地探究circ_Lrp6是否会调控血管疾病的发展,诱导ApoE-/-小鼠颈动脉狭窄后,给予circ_Lrp6-shRNA病毒敲低circ_Lrp6的表达后,可以明显抑制颈动脉狭窄导致的内膜增生程度。

 

总之,在小鼠和人的血管疾病过程中,miR-145circ_Lrp6的表达水平是存在差异调控的,而调节circ_Lrp6的表达可以影响到血管疾病的发展。在VSMCs中,circ_Lrp6具有促细胞增殖的效应,而miR-145具有促细胞分化的效应。当血管疾病发生发展的时候,内膜增生,血管平滑肌细胞中的miR-145表达下调,circ_Lrp6的表达可不发生改变。而当人为地敲低circ_Lrp6的表达,则上调miR-145的表达,进一步抑制内膜增生的程度,抑制血管变窄导致的后续血管疾病的发生发展。

 

 

 

 

参考文献

1. Hall IF, et al. Circ_Lrp6, a Circular RNA Enriched in Vascular Smooth Muscle Cells, Acts as a Sponge Regulating miRNA-145 Function. Circ Res. 2018 Nov 30. doi: 10.1161/CIRCRESAHA.118.314240.

2. Ballantyne MD, et al. Smooth Muscle Enriched Long Noncoding RNA (SMILR) Regulates Cell Proliferation. Circulation. 2016;133:2050-65.