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Nature Biotechnology:新型环状RNA表达载体
来源: | 作者:geneseed | 发布时间: 2019-04-10 | 141 次浏览 | 分享到:

48日,Nature Biotechnology杂志在线发表了一篇circRNA过表达技术的文章,介绍一种基于核酶(Ribosome)自剪切作用的新型环状RNA过表达体系,利用该体系,作者成功实现了基于环状RNA的适体(Aptamer)过表达[1]。文章通讯作者是洛克菲勒大学Samie R. Jaffrey博士。

 

过表达是研究环状RNA的重要基础技术,很多同行都用到了,为什么这样的工作也能发表到Nature Biotechnology杂志呢?他们的过表达技术有什么特殊的地方?解决了什么问题?下面就让我们一起来学习一下:

文章里的环状RNA过表达技术是怎样设计的?

作者为本文中所设计的环状RNA表达体系取名为“Tornado”,中文翻译过来是“龙卷风”的意思。Tornado环状RNA过表达载体的线性序列如下图顶部所示,该技术是基于具有自剪切功能的核酶(Ribosome)实现待环化序列的上下游切割,环化作用则借助于内源的RNA连接酶RtcB实现,最终的产物包含了待环化序列以及为实现环化而携带的Ligated stem序列,作者称其为racRNA

 

1  Tornado环状RNA过表达系统 ([1]

 

Tornado环状RNA过表达体系如何优化的?

作者早在2015年就曾经报道设计了基于tRNA的环状RNA过表达体系(tricY),tRNA加工成熟的过程中内含子区域可以借助RtcB实现自连环化[2]RtcB发挥功能的条件包括:需要一段茎环结构,需要5端的游离羟基和3端的2,3-环磷酸酯结构tRNA成熟过程的内切核酸酶可以完全实现这些元素,但过表达效率不是很理想,因此作者希望找到可以替代的核酶体系。最近报道的Twister核酸酶具有非常高的酶活性,并且能够产生5端的游离羟基和3端的2,3-环磷酸酯结构,比较符合预期。为尽可能减少核酶切割后残留的碱基,在待环化序列的下游3端选择了hatchet ribozymetype P1 Twister ribozyme (Oryza sativa Osa-1-4)。上游5端选择了Type P3 Twister from Nematostella vectensisTwister Sister versions 3 and 4the pistol ribozymeM4 construct from Lysinibacillus sphaericus)a minimal type I hammerhead ribozymetRNA成熟的过程中自剪切内含子两侧的颈环结构也是必须的,因此作者在Tornado体系中也保留了互补序列。为高效的分析环化效率,作者引入了适体Broccoli,这一适体在结合了DFHBI-1T后能够发出荧光。将Broccoli插入环化序列中,可直接在凝胶中通过DFHBI-1T染色观察产物生成的情况。结果表明当3端选择了P1 Twister5端选择Twister Sister, Pistol ribozyme 或者U2A mutation P3 Twister 时能够较高效率的获得中间产物RNase H可以将DNA互补的RNA分子切割,如果靶分子是环状RNA,借助互补探针和电泳,可以区分线性和环状RNA 产物。

 

2  Tornado体系优化 [1]

 

Tornado环状RNA过表达体系在细胞中的情况

293T细胞中,作者比较了不同环状RNA过表达技术的环化效率,结果表明在细胞内,Tornado体系比tricY体系的环化效率大大提高。


 

3  细胞内Tornado体系环化效率大大提高 [1]

 

基于Tornado体系的适体环状RNA过表达

适体的过表达一直比较难实现,上述的体系中基于Tornado体系实现了融合的荧光适体Broccoli的过表达,且效率较高。那么该体系是否也能适用于其他适体?作者挑选了NF-κB适体进行分析,结果表明细胞内基于Tornado体系将NF-κB适体融合至环状RNA中可有效发挥作用,表现为抑制下游基因IL-1β报告基因表达。

 

4  基于Tornado体系实现NF-κB适体有效表达 ([1]

 

此外,作者还基进一步尝试了可识别SAM的适体的过表达,成功构架了可在细胞内有效识别检测SAM的适体探针。

 

5  基于Tornado体系实现SAM识别适体探针有效表达 ([1]

 

本文开发的Tornado体系能够实现自动剪切,自动环化,可大大提高环状RNA的过表达,尤其是适体的体内过表达,为环状RNA的应用开辟了全新的领域,是RNA 适体和环状RNA应用技术的巨大进步,因此能够发表到Nature Biotechnology 杂志也算是实至名归。美中不足的是,Tornado体系依然携带了冗余序列,如何将这段冗余序列去掉,真正实现靶序列的高效环化依然还面临很多的困难。总而言之,本文的技术为环状RNA的应用提供了全新的技术方法,是一个重要的技术进步。

参考文献

1. Jaffrey, J.L.L.a.S.R., Highly efficient expression of circular RNA aptamers in cells using autocatalytic transcripts. Nature Biotechnology, 2019.

2. Lu, Z., et al., Metazoan tRNA introns generate stable circular RNAs in vivo. RNA, 2015. 21(9): p. 1554-65.

 

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