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技术前沿
Cell Death & Disease:m6A促进circCUX1稳定,介导下咽鳞状细胞癌放射耐受
来源: | 作者:geneseed | 发布时间: 2021-04-02 | 146 次浏览 | 分享到:

319日,Cell  Death & Disease杂志发表了一篇circRNA m6A修饰的文章,报道在下咽鳞状细胞癌中circCUX1携带m6A,直接结合Caspase-1mRNA 3-UTR,介导放射耐受。文章的通讯作者是中南大学湘雅医院的唐瑶云教授。

 

如何找到circCUX1

为分析下咽林状细胞癌(HPSCC)中差异表达的circRNA,作者从5HPSCC癌与癌旁标本中通过高通量测序分析差异circRNA。分些得到在HPSCC癌组织中有100种上调的circRNA53种下调的circRNA

 

1 高通量测序分析HPSCC差异circRNA )([1]

 

HPSCCcircCUX1表达显著升高,与不良预后有关

选择变化最显著的10circRNA,在10HPSCC癌与癌旁标本中进行QPCR验证,结果显示来自CUX1基因4-20外显子的circRNAcircCUX1)在HPSCC中表达升高最显著。头颈部肿瘤(HNSCC)及HOK细胞(人口腔角质细胞)中QPCR检测circCUX1表达,结果表明circCUX1HPSCC细胞系Fadu中表达最高,总体HNSCC细胞中表达均高于HOK细胞。在78HPSCC癌与癌旁组织中检测circCUX1表达,分析与放射敏感性的关系,结果显示,放射抵抗的标本中circCUX1显著高于放射敏感组及对照组。生存分析显示,circCUX1高表达的HPSCC预后显著更差。

 

2 HPSCCcircCUX1表达显著升高,与不良预后有关([1]

 

circCUX1的鉴定

circCUX1CUX1基因4-20外显子构成,背靠背引物,RNase R,放线菌素D实验,免疫荧光分析对circCUX1进行了鉴定。结果表明,circCUX1为反向剪切的环状RNA分子,耐受RNase R消化,细胞内circCUX1的半衰期更长。circCUX1主要定位在胞质中。

 

3 circCUX1的鉴定([1]

 

circCUX1携带m6A修饰

m6A是研究最多的RNA碱基修饰方式,作者基于meRIP-QPCR分析表明,circCUX1具有m6A修饰,RARA作为阳性对照。Anti-METTL3 RIP捕获了circCUX1,而Anti-METTL14RIP实验没有捕捉到circCUX1Pull-down WB检测也验证了METTL3可以结合circCUX1。有趣的是,在干扰METTL3后,circCUX1的表达显著下降,而CUX1母基因mRNA没有明显改变。防线菌素D实验进一步表明,METTL3介导的circCUX1 m6A修饰具有稳定circCUX1的作用。

 

4  circCUX1携带m6A修饰([1]

 

干扰circCUX1促进HPSCC放射敏感性

为分析circCUX1HPSCC中的功能,作者设计了circCUX1siRNA。作者发现干扰circCUX1可显著提高HPSCC细胞的放射敏感性,LD50显著降低。并且,即使没有经过放射处理,干扰circCUX1也可以诱导IL-1IL-18的分泌升高。

 

5干扰circCUX1促进HPSCC放射敏感性([1]

 

circCUX1结合并调控Caspase-1 mRNA的表达

文献报道,Caspase-1可以介导IL-1IL-18的切割和成熟,circCUX1是否调控了Caspase-1的表达?AREsite序列分析显示,circCUX1携带了“UUAUUU”的motif,可以直接与Caspase-1 mRNA 3-UTR 结合。设计该位点突变的Caspase-1后通过双荧光素酶报告载体检测,结果表明,干扰circCUX1显著促进野生型Caspase-1报告基因表达,但不改变突变型载体。这说明circCUX1具有直接结合并调控Caspase-1 mRNA的功能。RNA Pull-down实验进一步证明了circCUX1Caspase-1的结合。HPSCC临床标本中qPCR检测表明,放射抵抗的HPSCC标本中Caspase-1表达显著下降,HPSCC标本中Caspase-1表达显著低于对照组。相关性分析结果也表明,Caspase-1的表达与circCUX1呈现显著的负相关性。

 

6 circCUX1结合并调控Caspase-1 mRNA的表达([1]

 

HPSCCcircCUX1通过Caspase-1调控放射敏感性

上述结果表明circCUX1可以结合并调控Caspase-1的表达,Caspase-1可以介导IL-1IL-18的切割和成熟,那么,Caspase-1是否是circCUX1介导的放射抵抗作用的原因呢?为分析这个问题,作者在设计了circCUX1siRNA的同时,设计了Caspase-1siRNA。结果表明,干扰circCUX1IL-1IL-18的分泌量升高,但同步干扰Caspase-1后,表达恢复到对照组水平。CCK8实验也表明,单独干扰circCUX1后,HPSCC细胞的放射敏感性显著增强(LD50显著降低),而同步干扰Caspase-1后,LD50恢复到对照组水平。

 

7  HPSCCcircCUX1通过Caspase-1调控放射敏感性 ([1]

 

参考文献:

1. Wu, P., Fang, X., Liu, Y. et al. N6-methyladenosine modification of circCUX1 confers radioresistance of hypopharyngeal squamous cell carcinoma through caspase1 pathway. Cell Death Dis 12, 298 (2021). https://doi.org/10.1038/s41419-021-03558-2