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DNA sequencing
circRNA测序
来源: | 作者:geneseed | 发布时间: 2017-09-02 | 3756 次浏览 | 分享到:

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        circRNA是区别于传统线性RNA的一类新型RNA,具有闭合环状结构,大量存在于真核转录组中,数量多达十万种。circRNA对核酸酶不敏感,比线性RNA更为稳定,这使得circRNA在作为新型临床诊断标记物的开发应用上具有明显优势。目前筛选circRNA主要有两种途径,一是高通量测序,二是芯片检测。区别于芯片预制好的只能检测有限数量circRNA分子,高通量测序不仅通量大、信息准确,而且可以发现新的circRNA,是目前筛选circRNA最有效、性价比最高的方法。

 

技术路线

 

• Total RNA提取:根据不同的样品类型采用不同的提取方案,获得高质量的Total RNA。

• RNA质量检测:Nanodrop检测RNA样品浓度及纯度;琼脂糖凝胶电泳及Agilent 2100 Bioanalyzer检测RNA样品完整性。

• rRNA去除:针对不同物种选择合适的rRNA去除试剂盒去除样品中的rRNA。

• 线性RNA去除:RNase R酶切,去除线性RNA。

• RNA片段化:采用mg2+离子打断的方法,将RNA片段化至200-300bp。

• cDNA合成:随机引物反转录合成cDNA第一链;在合成cDNA第二链时掺入dUTP标记第二链,保留了RNA的链方向性。

• 加A尾,接头连接:cDNA两端引入接头序列及标记样品的index序列。

• PCR富集:PCR富集文库片段,文库大小为300-400bp。

• 文库质检:Agilent 2100 Bioanalyzer检测文库大小分布,Qubit 3.0或荧光定量PCR测定文库浓度。

• 上机测序:根据数据量要求将文库pooling上机测序。

• 数据分析:下机数据由专业生物信息分析团队进行数据分析,提供全面数据分析报告。

 

样品要求

 

• 样品类型:细胞、新鲜组织或RNA样品。

• 样品量:细胞样品请提供至少1×107个细胞,组织样品请提供至少300 mg的组织块或切片,RNA样品请提供10 μg以上的总RNA。

• 样品质量:RNA无明显降解,提取的总RNA,OD260/280值在1.8~2.2之间,浓度≥500 ng/μL,28S:18S ≥ 1.5,RIN ≥ 7。

• 样品保存:

    细胞样品:收集细胞至RNase Free 1.5 mL EP管,弃去培养基,用PBS洗一次,弃去PBS,把细胞沉淀保存在-80℃。

    组织样品:组织样品离体后放在冻存管中,迅速置于液氮下速冻1分钟以上,然后保存在-80℃。

    RNA样品:可将RNA溶于RNase Free 的超纯水中,-80℃保存。

    样品保存期间避免反复冻融。

• 样品运输:样品置于1.5 mL管中,封口膜封好,干冰运输。

 

测序方案

测序模式 PE150

测序数据量 10Gb clean data

 

生物信息分析内容

 

• 基础分析:

1 原始数据质控检查

2 比对结果质控检查

3 基于基因表达的样品主成分分析

4 差异基因表达及相关通路富集分析

5 circRNA预测及鉴定

6 circRNA差异分析

7 差异circRNA宿主基因的通路富集分析

8 差异circRNA的靶向miRNA预测分析

9 长链非编码RNA差异分析

 

• 高级分析:

1 基于基因表达的通路活性分析

2 circRNA及靶向miRNA网络调控制图

 

结果展示

 

        测序完成后,为了保证数据质量,我们会在信息分析前对原始数据进行质控,并且通过数据过滤来减少数据噪音。确保最终得到High quality clean reads,用于后续的信息分析。过滤的步骤包括:去除含adapter的reads;去除含N比例大于10%的reads;去除低质量reads(质量Q≤10的碱基数占整条read的 50% 以上)。

 

circRNA的鉴定和主要类型

    目前发现的circRNA主要来源于基因外显子,但多项研究也表明circRNA的类型比想象的要复杂,可以来自基因组上多种基因结构。

circRNA的主要类型示意图

circRNA在染色体上分布示意图

 

circRNA表达差异分析

 

    我们采用经典的RPKM算法统计circRNA的back-splicing位点处的junction reads数来归一化处理,edgeR软件计算筛选差异表达的circRNA,对p-value进行多重假设检验校正,FDR决定p-value的阈值得到q-value。

样品间差异表达circRNA火山图

样品间差异表达circRNA聚类热图

 

circRNA亲本基因富集分析

    在生物体内,不同基因相互协调行使其生物学,基于GO和Pathway的分析有助于更进一步了解基因的生物学功能。

 

Pathway和GO富集分析图

circRNA-mRNA-miRNA分子互作网络图


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高通量测序