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DNA sequencing
外显子组测序
来源: | 作者:geneseed | 发布时间: 2017-09-02 | 2540 次浏览 | 分享到:

外显子测序是指利用序列捕获技术将全基因组外显子区域DNA捕捉并富集后进行高通量测序的基因组分析方法。是一种选择基因组的编码序列的高效策略,外显子测序相对于基因组重测序成本较低,对研究已知基因的SNPIndel等具有较大的优势。外显子组测序主要用于识别和研究与疾病、种群进化相关的编码区及UTR区域内的结构变异。结合大量的公共数据库提供的外显子数据,有利于更好地解释所得变异结构之间的关联和致病机理。

 

 

技术路线

图释:Agilent SureSelect靶向序列捕获实验流程

• 基因组DNA提取:根据不同的样品类型采用不同的提取方案,获得高质量的基因组DNA

• DNA质量检测:Nanodrop检测DNA样品浓度及纯度;琼脂糖凝胶电泳检测DNA样品完整性。

• DNA片段化:采用超声波打断的方法,将DNA片段化至150-200bp

• 捕获前DNA文库构建:构建外显子捕获前DNA文库,引入接头序列及index序列。

捕获前DNA文库质检:Agilent 2100 Bioanalyzer检测文库大小分布,Qubit 3.0测定文库浓度。

• 外显子捕获:采用Agilent全外显子捕获试剂盒(v6+cosmic)。

捕获后PCR富集:PCR富集捕获后外显子文库片段。

外显子文库质检:Agilent 2100 Bioanalyzer检测文库大小分布,Qubit 3.0或荧光定量PCR测定文库浓度。

• 上机测序:根据数据量要求将文库pooling上机测序。

• 数据分析:下机数据由专业生物信息分析团队进行数据分析,提供全面数据分析报告。

 

样品要求

 

• 样品类型:细胞、新鲜组织或DNA样品。

• 样品量:细胞样品请提供至少5×106个细胞,组织样品请提供至少500mg的组织块或切片,DNA样品请提供5μg以上的总DNA

• 样品质量:DNA无明显降解,无蛋白污染,OD260/280≥ 1.5OD260/230≥ 1.0,浓度 ≥ 50 ng/μL

样品保存:

    细胞样品:收集细胞至RNase Free 1.5mL EP管,弃去培养基,用PBS洗一次,弃去PBS,把细胞沉淀保存在-80℃

    组织样品:组织样品离体后放在冻存管中,迅速置于液氮下速冻1分钟以上,然后保存在-80℃

DNA样品:可将DNA溶于Nuclease Free 的超纯水中,-20℃保存。

    样品保存期间避免反复冻融。

• 样品运输:样品置于1.5 mL管中,封口膜封好,冷冻运输。

 

测序方案

测序模式 PE150

测序数据量 9Gb clean data

 

生物信息分析内容

基础分析  

1 原始数据质控检查

2 比对结果质控检查

3 外显子覆盖率统计及制图

4 germline SNPInDel 检测、注释及统计

5 somatic SNPInDelCNV检测、注释及统计(成对样品)

 

高级分析 

6 稀有突变及疾病相关突变筛选

7 高频突变基因筛选

8 高频突变基因GO及通路分析

9 组间差异突变位点/基因比较

 

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