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DNA sequencing
RRBS甲基化测序
来源: | 作者:geneseed | 发布时间: 2017-09-02 | 3510 次浏览 | 分享到:

DNA甲基化研究一直是疾病研究的热点,与基因表达、表型性状息息相关。是基因调控的手段之一,通过对位于启动子及第一外显子区的CpG岛的甲基化而抑制基因的表达。在维持细胞正常功能、传递基因组印记,胚胎发育、肿瘤发生等方面起着至关重要的作用。      

        RRBSReduced Representation Bisulfite Sequencing)是一种准确且高性价比的DNA甲基化研究方法,在大规模临床样本的研究中有着广泛的应用。RRBS通过限制性内切酶对基因组进行酶切,富集启动子及CpG岛区域,再进行Bisulfite转化,用较小的数据量得到包含最多CpG位点甲基化信息的单碱基精度的甲基化图谱。

 

技术路线

 

基因组DNA提取:根据不同的样品类型采用不同的提取方案,获取高质量的基因组DNA

• DNA质量检测:Qubit检测DNA样品浓度,琼脂糖凝胶电泳检测DNA样品完整性。

• MspⅠ酶切:通过酶切富集CpG片段。

• 末端修复,加A,甲基化接头连接:DNA分子两端引入接头序列及index序列。

• 选择CpG富集的DNA片段

• Bisulfite转化:通过Bisulfite作用将非甲基化碱基C转化成U

• PCR富集:PCR扩增富集文库片段。

文库质检:Agilent 2100 Bioanalyzer检测文库大小分布,Qubit 3.0或荧光定量PCR测定文库浓度。

• 上机测序:根据数据量要求将文库pooling上机测序。

• 数据分析:下机数据由专业生物信息分析团队进行数据分析,提供全面数据分析报告。

 

样品要求

 

• 样品类型:细胞、新鲜组织或DNA样品。

• 样品量:细胞样品请提供至少5×106个细胞,组织样品请提供至少2-3 g的组织块或切片,DNA样品请提供6 μg以上的总DNA

• 样品质量:DNA无明显降解,无蛋白污染,OD260/280≥1.5OD260/230≥1.0,浓度≥50  ng/μL

样品保存:

    细胞样品:收集细胞至RNase Free 1.5 mL EP管,弃去培养基,用PBS洗一次,弃去PBS,把细胞沉淀保存在-80℃

    组织样品:组织样品离体后放在冻存管中,迅速置于液氮下速冻1分钟以上,然后保存在-80℃

    DNA样品:可将DNA溶于Nuclease Free 的超纯水中,-20℃保存。

    样品保存期间避免反复冻融。

• 样品运输:样品置于1.5 mL管中,封口膜封好,冷冻运输。

 

测序方案

测序模式 PE150

测序数据量 7.5Gb clean data

 

生物信息分析内容

1 原始数据质控检查;

2 甲基化序列比对结果分析;

3 测序深度及覆盖度统计;

4 计算C碱基的甲基化水平;

5 DNA甲基化信号在基因组的分布;

6 DNA甲基化信号的基因组元件注释;

7 DNA甲基化图谱绘制;

8 差异甲基化区域分析;


高通量测序