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 circRNA服务

circRNA服务
circRNA荧光素酶报告检测
来源: | 作者:geneseed | 发布时间: 2017-09-03 | 2108 次浏览 | 分享到:

一:技术简介

Luciferase报告基因系统是以荧光素(luciferin)为底物来检测萤火虫荧光素酶(fireflyluciferase)活性的一种报告系统。荧光素酶可以催化luciferin氧化成oxyluciferin,在luciferin氧化的过程中,会发出生物荧光(bioluminescence)。然后可以通过荧光测定仪也称化学发光仪(luminometer)或液闪测定仪测定luciferin氧化过程中释放的生物荧光。荧光素和荧光素酶这一生物发光体系,可以极其灵敏、高效地检测基因的表达。

二:应用原理

本实验适用于验证circRNA sponge功能,荧光素酶报告基因实验(luciferaseAssay)是检测某个circRNA和靶标miRNA特异性结合的重要手段。

其原理简述如下:

1)构建一个将circRNA特定片段插入到荧光素酶报告基因质粒,如psiCHECK等。

2)将要检测的miRNA与报告基因质粒共转染293细胞或其它相关的细胞系。如果此miRNA能够与circRNA结合,则荧光素酶基因就会下调,荧光素酶的表达量与miRNA-circRNA的作用强度成反比。

3) 加入特定的荧光素酶底物,荧光素酶与底物反应,产生荧光素,通过检测荧光的强度可以测定荧光素酶的活性,从而判断miRNA-circRNA的相互作用。

三:服务介绍

miRNAscircRNA吸附,理论上细胞内miRNA的总量不会产生变化,因此无法通过qRT-PCR检测来判断miRNA是否吸附。通常只能通过预测可能被吸附的miRNA,过表达circRNA后通过检测miRNA的下游基因表达差异,间接反映circRNA sponge功能。但这种方法,不能有效说明是circRNA -miRNA直接作用的结果。直接的证据在于Sensor reporter的构建与活性检测,我公司的技术人员利用psiCHECK质粒,对miRNAscircRNA的关系作出准确判断。

 

1)采用我公司特有的psiCHECK质粒;
        2)所采用的Luciferase双荧光报告系统,可以获得宽泛的线性定量范围与极高的灵敏度;
        3)采用瞬时转染技术,操作简便、快速,周期短,适用于绝大多数细胞类型。

服务内容
        1PCR扩增circRNA成熟序列,或直接合成结合位点序列;
        2)将上述DNA片段克隆至报告载体psiCHECK质粒;
        3)合成miRNA 模拟物;
        4)将报告载体与miRNA模拟物共转待检细胞;
        5)多功能酶标仪检测报告基因的表达水平。
客户提供
        1miRNAcircRNA的信息;

        2)相应检测细胞株。
我们提供 
        1)克隆含有circRNA或结合位点序列的报告质粒;

        2)检测结果与完整的实验报告。
质量保证 
        1)正确的测序结果;

        2)完整的对照实验分组。