circRNA翻译验证（T系列）
图1 circRNA翻译验证载体示意图
T1: circRNA-OE (circRNA过表达载体)
使用吉赛生物专利技术的第五代circRNA过表达载体进行构建，利用载体携带的侧翼成环框架（IR）使插入的circRNA序列准确剪切成环表达。包含细胞转染和RT-qPCR检测，保证插入的circRNA序列准确剪切成环过表达。
T2: circRNA-3xFlag (含3xFlag标签的circRNA过表达载体)
在circRNA-OE载体的基础上，于预测ORF的终止密码子前添加3xFlag标签序列，利用载体携带的侧翼成环框架（IR）使插入的含3xFlag标签的circRNA序列准确剪切成环表达。包含细胞转染和RT-qPCR检测，保证插入的circRNA序列准确剪切成环过表达。
T3: circRNA-3xFlag-△ATG（含3xFlag标签并删除ATG的circRNA过表达载体）
在circRNA-3xFlag载体的基础上，删除预测ORF的起始密码子ATG，利用载体携带的侧翼成环框架（IR）使插入的含3xFlag标签的circRNA序列准确剪切成环表达。
T4: circRNA-3xFlag-NC (含3xFlag标签并删除下游IR的载体，即不能成环的阴性对照)
在circRNA-3xFlag载体的基础上，删除载体下游的成环框架（IR），使能转录生成与circRNA-3xFlag相同的RNA序列但不剪切成环。该载体可作为阴性对照使用。
T5: circRNA-3xFlag-**aa (预测ORF的线性表达载体，即**aa的阳性对照)
使用与吉赛生物专利技术的第五代circRNA过表达载体相同骨架（不含成环框架）的载体进行构建，插入预测的ORF全长，使能转录生成线性化的ORF全长序列，并能正常翻译生成预测的多肽**aa。该载体可作为阳性对照使用。
注：
1. 本系列使用3xFlag标签序列，也可更换为V5或HA等其他标签。
2. 标签插入位置为ORF的终止密码子之前，即多肽**aa的C端。
参考文献：
1. Pamudurti NR, Bartok O, Jens M, Ashwal-Fluss R, Stottmeister C, Ruhe L, et al.. Translation of CircRNAs. Mol Cell 2017;66:9-21.e7. doi: 10.1016/j.molcel.2017.02.021.
2. Legnini I, Di Timoteo G, Rossi F, Morlando M, Briganti F, Sthandier O, et al.. Circ-ZNF609 is a circular RNA that can be translated and functions in myogenesis. Mol Cell 2017;66:22-37.e9. doi: 10.1016/j.molcel.2017.02.017.
3. Zhang M, Huang N, Yang X, Luo J, Yan S, Xiao F, et al.. A novel protein encoded by the circular form of the SHPRH gene suppresses glioma tumorigenesis. Oncogene. 2018 Mar;37(13):1805-1814. doi: 10.1038/s41388-017-0019-9. Epub 2018 Jan 18.
4. Zhang M, Zhao K, Xu X, Yang Y, Yan S, Wei P, et al.. A peptide encoded by circular form of LINC-PINT suppresses oncogenic transcriptional elongation in glioblastoma. Nat Commun. 2018 Oct 26;9(1):4475. doi: 10.1038/s41467-018-06862-2.
IRES活性检测（R系列）
图2 IRES验证载体示意图
R1: Empty Vector (Luc2空载体)
Luc2报告载体是基于海肾荧光素酶（Renilla Luciferase, R-Luc）和萤火虫荧光素酶（Firefly Luciferase, F-Luc）的cap-independent translation报告载体，R-Luc由5’ m7G帽子结构介导翻译起始，F-Luc只在插入有IRES（Internal Ribosome Entry Site）活性的序列或能介导翻译起始的序列时可以翻译。Luc2空载体含有多克隆酶切位点，命名为Luc2-IRES- Report。
R2: EMCV IRES (插入EMCV IRES序列的Luc2报告载体阳性对照)
Luc2阳性对照载体含有EMCV IRES序列，命名为Luc2-EMCV-IRES-Report。
R3: IRES (插入预测IRES序列的Luc2报告载体)
使用Luc2-IRES-Report载体进行构建，插入预测的IRES序列全长。
R4: IRES-Del1 (插入预测IRES前半部分序列的Luc2报告载体)
使用Luc2-IRES-Report载体进行构建，插入部分预测的IRES序列（已删除后半部分）。
R5: IRES-Del2 (插入预测IRES后半部分序列的Luc2报告载体)
使用Luc2-IRES-Report载体进行构建，插入部分预测的IRES序列（已删除前半部分）。
参考文献：
1. Pamudurti NR, Bartok O, Jens M, Ashwal-Fluss R, Stottmeister C, Ruhe L, et al.. Translation of CircRNAs. Mol Cell 2017;66:9-21.e7. doi: 10.1016/j.molcel.2017.02.021.
2. Yang Y, Gao X, Zhang M, Yan S, Sun C, Xiao F, et al.. Novel Role of FBXW7 Circular RNA in Repressing Glioma Tumorigenesis. J Natl Cancer Inst. 2018 Mar 1;110(3). doi: 10.1093/jnci/djx166.
3. Zhang M, Huang N, Yang X, Luo J, Yan S, Xiao F, et al.. A novel protein encoded by the circular form of the SHPRH gene suppresses glioma tumorigenesis. Oncogene. 2018 Mar;37(13):1805-1814. doi: 10.1038/s41388-017-0019-9. Epub 2018 Jan 18.
4. Zhang M, Zhao K, Xu X, Yang Y, Yan S, Wei P, et al.. A peptide encoded by circular form of LINC-PINT suppresses oncogenic transcriptional elongation in glioblastoma. Nat Commun. 2018 Oct 26;9(1):4475. doi: 10.1038/s41467-018-06862-2.
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