CRISPR/Cas13是继CRISPR/Cas9之后新发现的一类核酸酶系统,与Cas9靶向DNA不同,Cas13可以特异靶向RNA,实现对RNA的敲低、定点编辑、剪切调控和检测清除等。现已发现LwaCas13a、PspCas13b、PguCas13b、RanCas13b、EsCas13d、AdmCas13d、CasRx(RfxCas13d)等多个Cas13核酸酶,都可以靶向切割RNA,其中CasRx(RfxCas13d)具有最高的特异性和切割效率,也是目前发现最小的VI型CRISPR效应蛋白,能更容易利用AAV载体实现体内递送。
图1 CRISPR/CasRx系统敲低RNA示意图
CasRx靶向切割RNA时,靶标RNA的两端无需PFS,因此gRNA的设计更灵活,基本可靶向RNA的任意位置。与shRNA/CRISPRi等基因沉默技术相比,CRISPR/CasRx显示有更高的靶向特异性和敲低效率,以及最低的脱靶效应,表明其作为基因敲低工具的独特优势。
CasRx与核定位信号NLS融合表达时主要定位于细胞核,能更高效敲低mRNA及在细胞核内的其他RNA。
图2 CasRx (HA)的亚细胞定位(Konermann et al., 2018)
将gRNA设计为靶向环形RNA(circRNA)的反向剪切位点(back-splicing junction, BSJ)处时,CasRx能高效区分circRNA和其亲本基因mRNA,特异靶向敲低circRNA,而不影响mRNA。相比于siRNA/shRNA敲低circRNA时容易出现的效率低、脱靶或错误靶向mRNA,使用CRISPR/CasRx系统敲低circRNA是一个强有力的选择和补充工具。
图3 gRNA设计位置与circRNA/mRNA丰度(Li et al., 2020)。gRNA设计靶
向BSJ时,circRNA(红色)的丰度最低,而mRNA(蓝色)的丰度基本不变。
吉赛生物现提供四种整合型的载体,将CasRx和crRNA在同一个载体中表达,只需要设计合成gRNA序列并连接插入即可,载体构建和转染方便。
表1 四种载体区别及对应试剂盒货号
货号
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载体名称
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载体骨架
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U6-gRNA
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CMV-CasRx
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NLS
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GFP
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C0101-RL
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pCasRx-L1
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慢病毒载体
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有,NC
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有
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无
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有
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C0101-RNL
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pCasRxN-L1
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慢病毒载体
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有,NC
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有
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有
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有
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C0101-RA
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pCasRx-A1
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AAV载体
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有,NC
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有
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无
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无
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C0101-RNA
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pCasRxN-A1
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AAV载体
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有,NC
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有
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有
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无
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注:整合型载体为通用NC载体,含有non-targeting gRNA: TCACCAGAAGCGTACCATACTC。
产品特点:
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全新敲低技术,为实现circRNA敲低提供新选择。
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可定位于细胞核内,敲低效率更高。
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单一整合型载体同时表达CasRx和crRNA,载体构建和转染方便。