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circRNA CRISPR/CasRx敲低验证
来源: | 作者:geneseed | 发布时间: 2020-11-10 | 1992 次浏览 | 分享到:
CRISPR/Cas13是继CRISPR/Cas9之后新发现的一类核酸酶系统，与Cas9靶向DNA不同，Cas13可以特异靶向RNA，实现对RNA的敲低、定点编辑、剪切调控和检测清除等。现已发现LwaCas13a、PspCas13b、PguCas13b、RanCas13b、EsCas13d、AdmCas13d、CasRx（RfxCas13d）等多个Cas13核酸酶，都可以靶向切割RNA，其中CasRx（RfxCas13d）具有最高的特异性和切割效率，也是目前发现最小的VI型CRISPR效应蛋白，能更容易利用AAV载体实现体内递送。

图1  CRISPR/CasRx系统敲低RNA示意图
CasRx靶向切割RNA时，靶标RNA的两端无需PFS，因此gRNA的设计更灵活，基本可靶向RNA的任意位置。与shRNA/CRISPRi等基因沉默技术相比，CRISPR/CasRx显示有更高的靶向特异性和敲低效率，以及最低的脱靶效应，表明其作为基因敲低工具的独特优势。

CasRx与核定位信号NLS融合表达时主要定位于细胞核，能更高效敲低mRNA及在细胞核内的其他RNA。


图2  CasRx (HA)的亚细胞定位（Konermann et al., 2018）


将gRNA设计为靶向环形RNA（circRNA）的反向剪切位点（back-splicing junction, BSJ）处时，CasRx能高效区分circRNA和其亲本基因mRNA，特异靶向敲低circRNA，而不影响mRNA。相比于siRNA/shRNA敲低circRNA时容易出现的效率低、脱靶或错误靶向mRNA，使用CRISPR/CasRx系统敲低circRNA是一个强有力的选择和补充工具。

图3  gRNA设计位置与circRNA/mRNA丰度（Li et al., 2020）。gRNA设计靶
向BSJ时，circRNA（红色）的丰度最低，而mRNA（蓝色）的丰度基本不变。


吉赛生物现提供四种整合型的载体，将CasRx和crRNA在同一个载体中表达，只需要设计合成gRNA序列并连接插入即可，载体构建和转染方便。

表1 四种载体区别及对应试剂盒货号

货号

载体名称

载体骨架

U6-gRNA

CMV-CasRx

NLS

GFP

C0101-RL

pCasRx-L1

慢病毒载体

有，NC

有 无 有

C0101-RNL

pCasRxN-L1

慢病毒载体

有，NC

有 有 有

C0101-RA

pCasRx-A1

AAV载体

有，NC

有 无 无

C0101-RNA

pCasRxN-A1

AAV载体

有，NC

有 有 无
注：整合型载体为通用NC载体，含有non-targeting gRNA: TCACCAGAAGCGTACCATACTC。


产品特点：
  • 全新敲低技术，为实现circRNA敲低提供新选择。
  • 可定位于细胞核内，敲低效率更高。
  • 单一整合型载体同时表达CasRx和crRNA，载体构建和转染方便。

参考文献：
1. Konermann S, Lotfy P, Brideau NJ et al.. Transcriptome Engineering with RNA-Targeting Type VI-D CRISPR Effectors. Cell. 2018 Apr 19;173(3):665-676.e14. doi: 10.1016/j.cell.2018.02.033.
2. Li SQ, Li X, Xue W et al.. Screening for functional circular RNAs using the CRISPR-Cas13 system. bioRxiv 2020, DOI: 10.1101/2020.03.23.002865. 
3. Wessels HH, Méndez-Mancilla A, Guo X et al.. Massively parallel Cas13 screens reveal principles for guide RNA design. Nat Biotechnol. 2020 Jun;38(6):722-727. doi: 10.1038/s41587-020-0456-9.
4. Haibo Zhou, Jinlin Su, Xinde Hu et al.. Glia-to-Neuron Conversion by CRISPR-CasRx Alleviates Symptoms of Neurological Disease in Mice. Cell. 2020 Apr 30;181(3):590-603.e16. doi: 10.1016/j.cell.2020.03.024. Epub 2020 Apr 8.
5. Changyang Zhou, Xinde Hu, Cheng Tang et al.. CasRx-mediated RNA targeting prevents choroidal neovascularization in a mouse model of age-related macular degeneration. National Science Review, Volume 7, Issue 5, May 2020, Pages 835–837, https://doi.org/10.1093/nsr/nwaa033.
6. Bingbing He, Wenbo Peng, Jia Huang et al.. Modulation of metabolic functions through Cas13d-mediated gene knockdown in liver. Protein Cell. 2020 Jul;11(7):518-524. doi: 10.1007/s13238-020-00700-2.

附件：
seq-pCasRx-A1-pCasRxN-A1
seq-pCasRx-L1-pCasRxN-L1