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KDHPTM CRISPR/CasRx Vector Kit
来源: | 作者:geneseed | 发布时间: 2020-11-10 | 587 次浏览 | 分享到:
产品简介
CRISPR/Cas13是继CRISPR/Cas9之后新发现的一类核酸酶系统,与Cas9靶向DNA不同,Cas13可以特异靶向RNA,实现对RNA的敲低、定点编辑、剪切调控和检测清除等。现已发现LwaCas13a、PspCas13b、PguCas13b、RanCas13b、EsCas13d、AdmCas13d、CasRx(RfxCas13d)等多个Cas13核酸酶,都可以靶向切割RNA,其中CasRx(RfxCas13d)具有最高的特异性和切割效率,也是目前发现最小的VI型CRISPR效应蛋白,能更容易利用AAV载体实现体内递送。


图1  CRISPR/CasRx系统敲低RNA示意图

CasRx靶向切割RNA时,靶标RNA的两端无需PFS,因此gRNA的设计更灵活,基本可靶向RNA的任意位置。与shRNA/CRISPRi等基因沉默技术相比,CRISPR/CasRx显示有更高的靶向特异性和敲低效率,以及最低的脱靶效应,表明其作为基因敲低工具的独特优势。

CasRx与核定位信号NLS融合表达时主要定位于细胞核,能更高效敲低mRNA及在细胞核内的其他RNA。


图2  CasRx (HA)的亚细胞定位(Konermann et al., 2018)

将gRNA设计为靶向环形RNA(circRNA)的反向剪切位点(back-splicing junction, BSJ)处时,CasRx能高效区分circRNA和其亲本基因mRNA,特异靶向敲低circRNA,而不影响mRNA。相比于siRNA/shRNA敲低circRNA时容易出现的效率低、脱靶或错误靶向mRNA,使用CRISPR/CasRx系统敲低circRNA是一个强有力的选择和补充工具。


图3  gRNA设计位置与circRNA/mRNA丰度(Li et al., 2020)。gRNA设计靶
向BSJ时,circRNA(红色)的丰度最低,而mRNA(蓝色)的丰度基本不变。

KDHPTM CRISPR/CasRx载体试剂盒提供多种整合型载体,将CasRx和crRNA在同一个载体中表达,只需要设计合成gRNA序列并连接插入即可,载体构建和转染方便。试剂盒包含整合型通用NC载体,以及构建目标载体的配套试剂,无需酶切,通过一步反应即可快速构建CasRx/gRNA载体。

表1 四种载体区别及对应试剂盒货号

货号

载体名称

载体骨架

U6-gRNA

CMV-CasRx

NLS

GFP

C0101-RL

pCasRx-L1

慢病毒载体

有,NC

C0101-RNL

pCasRxN-L1

慢病毒载体

有,NC

C0101-RA

pCasRx-A1

AAV载体

有,NC

C0101-RNA

pCasRxN-A1

AAV载体

有,NC


注:整合型载体为通用NC载体,含有non-targeting gRNA: TCACCAGAAGCGTACCATACTC。








产品特点
简便:单一整合型载体同时表达CasRx和crRNA,仅需合成gRNA双链,一步反应即可构建。
快速:30分钟即可完成载体连接。
高效:连接克隆阳性率达95%以上。

运输与保存
4℃运输,-20℃保存,保质期一年,避免反复冻融。

产品组分

货号

规格

试剂组分

C0101-RL

20 rxns

Linearized CasRx Vector, From pCasRx-L1*

DNA Ligase Mix

10X Ligase Buffer

Nuclease-free Water

U6 Primer (10 μM)

gRNA-NC Vector, pCasRx-L1**

40 μL

10 μL

20 μL

200 μL

100 μL

2 μg

C0101-RNL

20 rxns

Linearized CasRx Vector, From pCasRxN-L1*

DNA Ligase Mix

10X Ligase Buffer

Nuclease-free Water

U6 Primer (10 μM)

gRNA-NC Vector, pCasRxN-L1**

40 μL

10 μL

20 μL

200 μL

100 μL

2 μg

C0101-RA

20 rxns

Linearized CasRx Vector, From pCasRx-A1*

DNA Ligase Mix

10X Ligase Buffer

Nuclease-free Water

U6 Primer (10 μM)

gRNA-NC Vector, pCasRx-A1**

40 μL

10 μL

20 μL

200 μL

100 μL

2 μg

C0101-RNA

20 rxns

Linearized CasRx Vector, From pCasRxN-A1*

DNA Ligase Mix

10X Ligase Buffer

Nuclease-free Water

U6 Primer (10 μM)

gRNA-NC Vector, pCasRxN-A1**

40 μL

10 μL

20 μL

200 μL

100 μL

2 μg

*: Linearized CasRx Vector为对应载体去除non-targeting gRNA序列的开环载体,末端保留连接定位序列。
**: gRNA-NC Vector为含有non-targeting gRNA的通用NC载体,与Linearized CasRx Vector为同一骨架。

实验流程

图4  CRISPR/CasRx Knockdown Cloning Kit实验流程图

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