circRNA是区别于传统线性RNA的一类新型RNA，具有闭合环状结构，大量存在于真核转录组中，数量多达十万种。circRNA对核酸酶不敏感，比线性RNA更为稳定，这使得circRNA在作为新型临床诊断标记物的开发应用上具有明显优势。目前筛选circRNA主要有两种途径，一是高通量测序，二是芯片检测。区别于芯片预制好的只能检测有限数量circRNA分子，高通量测序不仅通量大、信息准确，而且可以发现新的circRNA，是目前筛选circRNA最有效、性价比最高的方法。

技术路线

 

样品要求

        样品类型：细胞、新鲜组织、FFPE组织、血液或RNA样品。

        物种：人、大小鼠（特殊物种详询技术支持）

        具体样品量要求及样本采集、保存和运输方法请参照附录一。

测序方案

        测序模式 PE150

        测序数据量 10Gb 

生物信息分析内容

        1 原始数据质控检查

        2 比对结果质控检查

        3 基于circRNA表达的样品主成分分析

        4 circRNA预测及鉴定

        5 circRNA差异分析

        6 差异circRNA宿主基因的通路富集分析

        7 差异circRNA的靶向miRNA预测分析

高级分析

        1 circRNA及靶向miRNA网络调控制图

案例展示

        1 人喉鳞状细胞癌中circRNA的RNA-seq表达谱

        RNA-Seq profiling of circular RNAs in human laryngeal squamous cell carcinomas

        Lu et al. Molecular Cancer (2018) 17:86
        https://doi.org/10.1186/s12943-018-0833-x  IF：6.204

        测序策略：circRNA测序（RNase R+）

        样本分组：10例，5例肿瘤组织（2例高分化，3例中分化），5例正常组织

        人喉鳞状细胞癌(LSCC)是起源于喉黏膜上皮组织的恶性肿瘤，是头颈部肿瘤中恶性程度非常强的肿瘤，世界范围内每年发生率占比2.4%，近年内还有逐渐增加趋势。本研究主要关注circRNA在LSCC疾病中的表达情况。研究者选择10例LSCC患者临床组织标本（2例高分化、3例为中分化、 5例正常）进行RNA高通量测序，分析样本中circRNA表达情况。共鉴定出21444个circRNA，其中在LSCC样本中显著上调的circRNA 29个，显著下调circRNA 19个，进一步结合临床特征（高分化，中分化和正常）进行分类，将差异表达circRNA缩小到18个和5个（图1）。CircRNA-miRNA-mRNA调控网络预测分析，发现20个失调控circRNA与多种肿瘤相关的miRNA相关，信号通路KEGG富集分析发现，过氧化物酶体PPAR、轴突导向、Wnt和细胞周期通路与LSCC密切相关（图2）。随后的qPCR验证结果显示（图3），has_circ:chr20:31876585-31,897,648可以很好区分LSCC标本和正常标本，表明circRNA可作为LSCC潜在的理想标志物。

 

图1 LSCC样本中circRNA差异表达谱

 

图2 CircRNA及靶向miRNA网络调控图与KEGG代谢通路富集分析

 

图3: hsa_circ:chr20:31876585–31,897,648在10对LSCC肿瘤样本及正常样本中的Q-PCR验证

吉赛生物NGS样本采集、保存、运输要求（2020年version2.2）