hsa_circ_00AAAA-F1   AAAAAAAAAAAAAAAAAAA       

hsa_circ_00AAAA-R1   AAAAAAAAAAAAAAAAAAA   

产物大小   129bp

1. 怎么提取和逆转录circRNA ?

常用细胞组织等样品提取total RNA，其中包含mRNA、lncRNA、miRNA和circRNA等所有的RNA种类，暂没有方法直接提取circRNA。但可以对total RNA进行RNase R消化处理，以使circRNA得到富集。

对total RNA或RNase R处理的RNA进行逆转录，应使用随机引物，不能使用oligo(dT)，因为circRNA没有polyA尾。逆转录过程中circRNA模板是呈环形的，逆转录的cDNA第一链是线性的单链DNA，后续的PCR产物是线性的双链DNA。

2. 如何针对外显子环化的circRNA和内含子环化的circRNA设计引物？

外显子环化的circRNA设计引物时需要特异性地针对环化位点处来设计引物。而内含子环化的circRNA，既可跨环化位点设计引物，也可围绕内含子区域设计引物。

3. 做circRNA逆转录的时候，是否可以单独用Oligo（dT）引物来逆转？

不可以。circRNAs是一类不具有5' 末端帽子和3' 末端poly(A)尾巴，并以共价键形成环形结构的非编码RNA分子。

4.如何确定引物的特异性？

由于circRNA的结构特殊性，引物设计出来之后，还需要做qPCR实验来验证引物的特异性。确定circRNA引物的特异性主要有以下3步：

a.溶解曲线

溶解曲线单峰，Tm值在正常范围之内

b.电泳图

电泳条带单一，条带大小正确

c.Sanger测序

测序结果单峰，环化位点正确