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circRNA测序 | circRNA-seq
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常见问题

circRNA是区别于传统线性RNA的一类新型RNA,具有闭合环状结构,大量存在于真核转录组中,数量多达十万种。circRNA对核酸酶不敏感,比线性RNA更为稳定,这使得circRNA在作为新型临床诊断标记物的开发应用上具有明显优势。目前筛选circRNA主要有两种途径,一是高通量测序,二是芯片检测。区别于芯片预制好的只能检测有限数量circRNA分子,高通量测序不仅通量大、信息准确,而且可以发现新的circRNA,是目前筛选circRNA最有效、性价比最高的方法。


技术路线



测序方案

        测序平台 Illumina Novaseq 6000

        测序模式 PE150

        测序数据量 10Gb


人喉鳞状细胞癌中circRNA的RNA-seq表达谱

RNA-Seq profiling of circular RNAs in human laryngeal squamous cell carcinomas

Lu et al. Molecular Cancer (2018) 17:86(IF:6.204)

测序策略:circRNA测序(RNase R+)

样本分组:10例,5例肿瘤组织(2例高分化,3例中分化),5例正常组织

人喉鳞状细胞癌(LSCC)是起源于喉黏膜上皮组织的恶性肿瘤,是头颈部肿瘤中恶性程度非常强的肿瘤,世界范围内每年发生率占比2.4%,近年内还有逐渐增加趋势。本研究主要关注circRNA在LSCC疾病中的表达情况。研究者选择10例LSCC患者临床组织标本(2例高分化、3例为中分化、 5例正常)进行RNA高通量测序,分析样本中circRNA表达情况。共鉴定出21444个circRNA,其中在LSCC样本中显著上调的circRNA 29个,显著下调circRNA 19个,进一步结合临床特征(高分化,中分化和正常)进行分类,将差异表达circRNA缩小到18个和5个(图1)。CircRNA-miRNA-mRNA调控网络预测分析,发现20个失调控circRNA与多种肿瘤相关的miRNA相关,信号通路KEGG富集分析发现,过氧化物酶体PPAR、轴突导向、Wnt和细胞周期通路与LSCC密切相关(图2)。随后的qPCR验证结果显示(图3),has_circ:chr20:31876585-31,897,648可以很好区分LSCC标本和正常标本,表明circRNA可作为LSCC潜在的理想标志物。




1 LSCC样本中circRNA差异表达谱


2 CircRNA及靶向miRNA网络调控图与KEGG代谢通路富集分析

3 hsa_circ:chr20:31876585–31,897,64810LSCC肿瘤样本及正常样本中的Q-PCR验证






生物信息分析结果

基础分析结果

原始数据质控检查(碱基质量评估,序列质量评估)

比对结果质控检查

基因覆盖度分析

circRNA预测及鉴定

circRNA序列预测

基于circRNA表达的样品主成分分析

高级分析结果

circRNA差异分析

差异circRNA宿主基因的GO功能分析

差异circRNA宿主基因的KEGG通路分析

差异circRNA宿主基因的Rectome通路分析

差异circRNA的靶向miRNA预测分析

差异circRNA及靶向miRNA网络调控制图


部分结果展示

Figure.CircRNAs with significant differential expression were classified by different genomic loci (exonic, intronic, antisense, intragenic, and intergenic).

(引自客户文章:Geng xiuzhao,etl,Aging (Albany NY),2021

文章标题:Screening and functional prediction of differentially expressed circular RNAs in human glioma of different grades)

Figure.
Volcano plot depicting circRNAs.

Circos plot revealing where each circRNA is located on human chromosomes

(引自客户文章:Geng xiuzhao,etl,Aging (Albany NY),2021

文章标题:Screening and functional prediction of differentially expressed circular RNAs in human glioma of different grades)

Figure.Heat map analysis of the expression of circRNAs

Volcano plot representing the expression fold changes in circRNAs

(引自客户文章:Gong liping,etl,EMBO Rep. ,2020

文章标题:Epstein-Barr virus-derived circular RNA LMP2A induces stemness in EBV-associated gastric cancer)


图文展示(3)

Table.circRNA-seq原始样本送样建议

送样类型

送样量

备注

细胞 (细胞数)

≥1*10^6

无支原体污染

动物组织

≥100 mg


植物组织

≥100 mg


全血

≥4 mL


FFPE

8-10片,未染色,厚度10 μm



Table.circRNA-seq RNA样本送样建议

送样类型

送样量

完整性(RIN值)

浓度

其他

纯度

total RNA(组织、细胞、全血等)

≥4 μg

≥7

≥100ng/μl


无DNA,蛋白/盐离子等污染,样本无色透明不粘稠

FFPE组织RNA

≥4 μg

≥3

/

DV200>30%

*更具体的送样方法请咨询销售或技术支持

物种范围:人、小鼠、大鼠等哺乳动物,拟南芥、水稻、番茄、玉米、大豆等植物,详询销售或技术支持


Q1:circRNA测序与全转录组测序有什么不同?

A1全转录组测序采用去rRNA链特异性的建库方式,数据分析内容包含了mRNAlncRNAcircRNA全部信息,数据质量较好。CircRNA测序采用去rRNA去线性链特异性的建库方式,通过RNase R 消化线性RNA从而富集circRNA,对建库起始量要求较高(一般大于2μg),测序数据质量较全转录组稍差,但可将circular junction reads数提高10倍以上,更适合专注circRNA研究的项目。


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