2020年9月14日，中山大学孙逸仙纪念医院苏士成教授合作团队在Cell杂志（IF 41.584)上发表了题为Targeting Mitochondria-Located circRNA SCAR Alleviates NASH via Reducing mROS Output的文章，该文章应用Arraystar Human CircRNA芯片筛选鉴定出与非酒精性脂肪性肝炎发生相关的环状RNA分子SCAR，并发现在线粒体中过表达circRNA SCAR能够抑制肝脏成纤维细胞的活化与相应的炎症反应，敲低则有相反的表型。并且作者使用吉赛公司过表达载体 pcD-ciR 通过插入3×flag标签以及预测的ORF序列（图1），发现circRNA SCAR无法编码蛋白质，随后作者通过一系列实验发现该circRNA能够直接与ATP5B结合并发挥生物学功能[1]。作者团队发现了线粒体circRNA的重要功能并发展了一系列相关的实验方法，为免疫代谢疾病提供了一种有吸引力的治疗策略。

参考文献：

Qiyi Zhao, Jiayu Liu, Hong Deng, et al. Targeting Mitochondria-Located circRNA SCAR Alleviates NASH via Reducing mROS Output.Cell (2020), https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.08.009

qRT-PCR检测：

表1 hsa_circ_00AAAAA的相对表达差异

图1 hsa_circ_00AAAAA的相对表达量

qPCR产物测序结果：

注：hsa_circ_00AAAAA在circBase中的环化位点序列GATTATGGAAACAGCTTTTTATAACTATGATG

结论：

相比于对照组，CAAAAA组的过表达倍数为***；PCR产物测序峰图正常，无杂峰或叠带，序列与环化位点参考序列对比吻合。以上结果表明CAAAAA能在真核细胞中成功过表达目的hsa_circ_00AAAAA。

1. circRNA过表达怎么做？

CircRNA的形成和线性RNA不同，因此对circRNA的过表达不能直接将序列连接到常规的真核表达载体（如pcDNA3.1）来进行。已明确的circRNA形成依赖于侧翼序列中的反向互补序列（RCMs，如Alu元件）或与能调控circRNA生成的蛋白（如QKI）的结合位点，因此构建载体时可以在circRNA序列上下游分别增加一段反向互补的序列，质粒转染细胞后会先转录出上游+circRNA+下游的线性RNA链，再依靠长下游的反向互补配对促使成环。

2. circRNA过表达成功标准？

载体构建好后瞬时转染细胞进行RT-PCR检测以验证过表达效率。

1）qPCR检测有过表达倍数，质粒瞬转效率高，基因本底丰度不太高的话一般都可以过表达50倍以上；

2）使用Divergent引物检测过表达的PCR产物是大小正确的单一条带，PCR产物进行sanger测序确定成环序列准确。满足这两个条件才可以认为载体实现了对circRNA的准确高效率过表达。