circRNA技术服务
高通量测序服务
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自2015年推出circRNA过表达载体(国家授权发明专利:201510566302)以来,吉赛生物一直致力于circRNA过表达技术的改进和相关产品开发,持续优化现有的载体产品,目前已全面升级为第五代。 第五代circRNA过表达载体有pCD5-ciR、pCD25-ciR、pLO5-ciR、pLC5-ciR、pK5ssAAV-ciR和pK25ssAAV-ciR,能满足普通真核表达、慢病毒包装和腺相关病毒(AAV)包装等多种用途。载体均携带优化过的侧翼成环框架,含有精心改造的Alu元件、QKI等RBP的结合位点,并使用全新设计的环化介导序列,能确保插入的circRNA准确高效环化。
过表达载体图谱
技术优势 1. 过表达效率高:显著过表达50倍以上,最高可达上万倍; 2. 序列环化准确:有效保证目标circRNA的线性序列准确环化,无碱基添加或缺失; 3. 稳定性高:200nt~2000nt序列均能实现准确高效过表达; 4. 适用范围广:可用于细胞瞬时转染、包装慢病毒或腺相关病毒,同时可提供GFP绿色荧光蛋白标记和嘌呤霉素抗性基因标记,适用不同实验需求。
项目明细 1. 载体构建; 2. 瞬时转染(人293T细胞验证); 3. 引物设计合成; 4. qPCR验证(三次重复含内参); 5. Sanger测序验证。
客户提供 1. circRNA名称(ID)、长度、序列、物种; 2. 指定载体名称。
交付标准 1. 过表达质粒:2 μg质粒+200 μL甘油菌; 2. 对照质粒:2 μg质粒+200 μL甘油菌; 3. 载体构建与验证实验报告: ①载体构建步骤; ②载体测序验证结果原始文件; ③细胞转染实验步骤; ④qPCR检测原始数据及qPCR产物测序原始文件; ⑤qPCR检测实验步骤; ⑥载体构建与验证实验报告。 2020年9月14日,中山大学孙逸仙纪念医院苏士成教授合作团队在Cell杂志(IF 41.584)上发表了题为Targeting Mitochondria-Located circRNA SCAR Alleviates NASH via Reducing mROS Output的文章,该文章应用Arraystar Human CircRNA芯片筛选鉴定出与非酒精性脂肪性肝炎发生相关的环状RNA分子SCAR,并发现在线粒体中过表达circRNA SCAR能够抑制肝脏成纤维细胞的活化与相应的炎症反应,敲低则有相反的表型。并且作者使用吉赛公司过表达载体 pcD-ciR 通过插入3×flag标签以及预测的ORF序列(图1),发现circRNA SCAR无法编码蛋白质,随后作者通过一系列实验发现该circRNA能够直接与ATP5B结合并发挥生物学功能[1]。作者团队发现了线粒体circRNA的重要功能并发展了一系列相关的实验方法,为免疫代谢疾病提供了一种有吸引力的治疗策略。 参考文献: Qiyi Zhao, Jiayu Liu, Hong Deng, et al. Targeting Mitochondria-Located circRNA SCAR Alleviates NASH via Reducing mROS Output.Cell (2020), https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.08.009 qRT-PCR检测: 表1 hsa_circ_00AAAAA的相对表达差异
图1 hsa_circ_00AAAAA的相对表达量 qPCR产物测序结果: 注:hsa_circ_00AAAAA在circBase中的环化位点序列GATTATGGAAACAGCTTTTTATAACTATGATG 结论: 相比于对照组,CAAAAA组的过表达倍数为***;PCR产物测序峰图正常,无杂峰或叠带,序列与环化位点参考序列对比吻合。以上结果表明CAAAAA能在真核细胞中成功过表达目的hsa_circ_00AAAAA。 1. circRNA过表达怎么做? CircRNA的形成和线性RNA不同,因此对circRNA的过表达不能直接将序列连接到常规的真核表达载体(如pcDNA3.1)来进行。已明确的circRNA形成依赖于侧翼序列中的反向互补序列(RCMs,如Alu元件)或与能调控circRNA生成的蛋白(如QKI)的结合位点,因此构建载体时可以在circRNA序列上下游分别增加一段反向互补的序列,质粒转染细胞后会先转录出上游+circRNA+下游的线性RNA链,再依靠长下游的反向互补配对促使成环。
2. circRNA过表达成功标准? 载体构建好后瞬时转染细胞进行RT-PCR检测以验证过表达效率。 1)qPCR检测有过表达倍数,质粒瞬转效率高,基因本底丰度不太高的话一般都可以过表达50倍以上; 2)使用Divergent引物检测过表达的PCR产物是大小正确的单一条带,PCR产物进行sanger测序确定成环序列准确。满足这两个条件才可以认为载体实现了对circRNA的准确高效率过表达。 |