circRNA qPCR引物设计circRNA qPCR检测全转录组测序 | RNA-seqcircRNA测序 | circRNA-seq外泌体RNA测序 | Exosome RNA-seq生物医学大数据挖掘circRNA qPCR引物设计合成(1)circRNA表达分析circRNA过表达实验circRNA干扰实验细胞功能实验慢病毒包装circRNA功能分析RNA m6A甲基化测序 | MeRIP-SeqcircRNA表观转录组T系列-circRNA翻译验证R系列-IRES活性检测核糖体印迹测序 | Ribo-seq核糖体-新生肽链复合物测序 | RNC-seqcircRNA翻译-验证研究circRNA注释及功能预测circRNA荧光素酶报告检测circRNA RIP实验circRNA pull-down实验circRNA FISH探针合成circRNA相互作用组学研究circRNA FISH探针合成circRNA定位分析circRNA全长纳米孔测序 | ONT circRNA full-length Sequencin三代测序全转录组测序 | RNA-seqcircRNA测序 | circRNA-seqmRNA测序 | mRNA-seq小RNA测序 | miRNA-seq转录组学研究核糖体印迹测序 | Ribo-seq核糖体-新生肽链复合物测序 | RNC-seq翻译组学研究RNA m6A甲基化测序 | MeRIP-Seq染色质开放性测序 | ATAC-seq表观组学研究10×Visium空间转录组测序空间转录组学研究外泌体RNA测序 | Exosome RNA-seq外泌体提取及鉴定外泌体研究RNA免疫共沉淀测序 | RIP-seq染色质免疫共沉淀测序 | ChIP-seq核酸蛋白互作研究微生物宏基因组测序 | Metagenomics Sequencing基因组学研究生物医学大数据挖掘分析circRNA定制化分析及绘图常规组学及多组学联合分析单细胞测序数据生信分析生物信息学分析服务(右边模板)科研服务RNase RcircRNA qRT-PCR试剂盒circRNA检测circRNA过表达系列circRNA过表达载体系列血液基因组DNA提取试剂盒全血RNA提取试剂盒细胞RNA提取试剂盒核酸提取与纯化RNA pull-down试剂盒RIP试剂盒T7转录试剂盒(生物素标记)分子互作系列外泌体提取试剂盒Taqman探针法支原体检测试剂盒(UNG防污染版)支原体检测核糖体RNA去除试剂盒(人/大鼠/小鼠)核糖体RNA去除试剂盒(植物)RNA-seq文库构建试剂盒RNA建库接头试剂DNA磁珠RNA磁珠高通量测序系列circRNA标准品系列CircLucT7耐高温高产量RNA合成试剂盒环状RNA合成试剂盒T4 RNA连接酶1T4 RNA连接酶2circRNA制备系列(右边模板)产品中心
circRNA过表达实验
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2015年推出circRNA过表达载体(国家授权发明专利:201510566302)以来,吉赛生物一直致力于circRNA过表达技术的改进和相关产品开发,持续优化现有的载体产品,目前已全面升级为第五代


第五代circRNA过表达载体有pCD5-ciRpCD25-ciRpLO5-ciRpLC5-ciRpK5ssAAV-ciRpK25ssAAV-ciR,能满足普通真核表达、慢病毒包装和腺相关病毒(AAV)包装等多种用途。载体均携带优化过的侧翼成环框架,含有精心改造的Alu元件、QKIRBP的结合位点,并使用全新设计的环化介导序列,能确保插入的circRNA准确高效环化。



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过表达载体图谱


技术优势

1. 过表达效率高:显著过表达50倍以上,最高可达上万倍

2. 序列环化准确:有效保证目标circRNA的线性序列准确环化,无碱基添加或缺失

3. 稳定性高:200nt~2000nt序列能实现准确高效过表达。

4. 适用范围广:可用细胞瞬时转染包装慢病毒或腺相关病毒同时可提供GFP绿色荧光蛋白标记和嘌呤霉素抗性基因标记,适用不同实验需求。


项目明细

1. 载体构建

2. 瞬时转染(人293T细胞验证)

3. 引物设计合成

4. qPCR验证(三次重复含内参)

5. Sanger测序验证


客户提供

1. circRNA名称(ID)、长度、序列、物种

2. 指定载体名称


交付标准

1. 过表达质粒:2 μg质粒+200 μL甘油菌

2. 对照质粒:2 μg质粒+200 μL甘油菌

3. 载体构建与验证实验报告:

载体构建步骤

载体测序验证结果原始文件

细胞转染实验步骤

④qPCR检测原始数据及qPCR产物测序原始文件

⑤qPCR检测实验步骤

载体构建与验证实验报告


2020年9月14日,中山大学孙逸仙纪念医院苏士成教授合作团队在Cell杂志IF 41.584)上发表了题为Targeting Mitochondria-Located circRNA SCAR Alleviates NASH via Reducing mROS Output文章,该文章应用Arraystar Human CircRNA芯片筛选鉴定出与非酒精性脂肪性肝炎发生相关的环状RNA分子SCAR,并发现线粒体中过表达circRNA SCAR能够抑制肝脏成纤维细胞的活化相应的炎症反应,敲低则有相反的表型。并且作者使用吉赛公司过表达载体 pcD-ciR 通过插入3×flag标签以及预测的ORF序列图1),发现circRNA SCAR无法编码蛋白质后作者通过一系列实验发现该circRNA能够直接与ATP5B结合发挥生物学功能[1]作者团队发现了线粒体circRNA的重要功能并发展了一系列相关的实验方法,为免疫代谢疾病提供了一种有吸引力的治疗策略。

参考文献:

Qiyi Zhao, Jiayu Liu, Hong Deng, et al. Targeting Mitochondria-Located circRNA SCAR Alleviates NASH via Reducing mROS Output.Cell (2020), https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.08.009




qRT-PCR检测

1 hsa_circ_00AAAAA的相对表达差异


Sample name
GAPDH
Average CT
has_circ_00AAAAA
Average CT
2-ΔΔCT1
2-ΔΔCT2
2-ΔΔCT3
Average 2-ΔΔCT±SD
SEM
293T-control
19.25±0.26
29.6±0.36
0.76
1.24
1.06
1±0.24
0.14
293T-pLC5-ciR
18.7±0.27
29.56±0.13
0.68
0.78
0.66
0.71±0.07
0.04
293T-CAAAAA
18.96±0.24
20.13±0.08
608.27
548.02
594.46
583±31.57
18.22

1 hsa_circ_00AAAAA的相对表达


qPCR产物测序结果


注:hsa_circ_00AAAAA在circBase中的环化位点序列GATTATGGAAACAGCTTTTTATAACTATGATG


结论

相比于对照组,CAAAAA组的过表达倍数为***;PCR产物测序峰图正常,无杂峰或叠带,序列与环化位点参考序列对比吻合。以上结果表明CAAAAA能在真核细胞中成功过表达目的hsa_circ_00AAAAA










1. circRNA过表达怎么做?

CircRNA的形成和线性RNA不同,因此对circRNA的过表达不能直接将序列连接到常规的真核表达载体(如pcDNA3.1)来进行。已明确的circRNA形成依赖于侧翼序列中的反向互补序列(RCMs,如Alu元件)或与能调控circRNA生成的蛋白(如QKI)的结合位点,因此构建载体时可以在circRNA序列上下游分别增加一段反向互补的序列,质粒转染细胞后会先转录出上游+circRNA+下游的线性RNA链,再依靠长下游的反向互补配对促使成环。


2. circRNA过表达成功标准?

载体构建好后瞬时转染细胞进行RT-PCR检测以验证过表达效率。

1)qPCR检测有过表达倍数,质粒瞬转效率高,基因本底丰度不太高的话一般都可以过表达50倍以上;

2)使用Divergent引物检测过表达的PCR产物是大小正确的单一条带,PCR产物进行sanger测序确定成环序列准确。满足这两个条件才可以认为载体实现了对circRNA的准确高效率过表达。


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