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circRNA干扰实验
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针对circRNA的接头序列设计siRNA序列特异性敲低目的circRNA的表达对于每条选定的siRNA靶序列,设计 正义链和反义链,以 loop9nt or 10nt 相连,构建shRNA质粒直接转染或通过病毒包装后转染细胞,并对转染细胞进行阳性鉴定和转代细胞株的培养,最终实现对特定circRNA特异性敲低的作用。


81.png

针对circRNA circPAIP2进行siRNA敲低实验示意图

技术优势

1. shRNA载体转染效率高、操作简单、RNA沉默效果易于检测

2. 设计circRNA Divergent primers检测敲低circRNA的效率

3. 特异性敲低circRNA的表达,不影响亲本线性基因的表达


客户提供

1. mRNA/lncRNA需要提供基因名称(ID号)、种属;

2. circRNA需要提供基因名称(ID号)或者完整序列、种属。


交付标准

1. siRNA序列+剩余siRNA;

2. 筛选验证报告(细胞转染+qPCR检测)。


qPCR检测结果

1 NNN细胞中has_circ_000XXXX相对表达差异


Sample name

GAPDH

Average CT

hsa_circ_000XXXX

Average CT

2-ΔΔCT1

2-ΔΔCT2

2-ΔΔCT3

Average 2-ΔΔCT±SD

SEM

NNN-control

13.87±0.12

25.66±0.09

1.07

0.98

0.96

1±0.06

0.03

NNN-si-NC

13.9±0.07

25.68±0.1

1.03

1.06

0.93

1.01±0.07

0.04

NNN-si-1

13.83±0.11

26.36±0.08

0.56

0.6

0.63

0.6±0.03

0.02

NNN-si-2

13.79±0.16

26.53±0.05

0.5

0.51

0.54

0.52±0.02

0.01

NNN-si-3

13.84±0.08

27.21±0.08

0.33

0.36

0.32

0.34±0.02

0.01




1 NNN细胞中has_circ_000XXXX相对表达差异







1. circRNA 的沉默(干扰)怎么做?

基于RNAi技术对基因进行沉默,实验中一般设计合成靶标基因的siRNA,瞬转细胞后进行RT-PCR检测。

外显子来源的circRNA因为和mRNA有同样的外显子序列,在序列内部设计siRNA靶标无法保证特异性,因此只能针对junction位点处设计靶标序列,前后移动范围有限,siRNA通常很难设计。EiciRNA或者内含子来源的环形RNA,除了针对junction位点处设计靶标外,也可以尝试在内含子序列上设计。


2. 设计siRNA为什么不能连续G\C超过3个,连续A\T超过4个?

因为连续 3个以上的 G 和 C 可以降低双链 RNA 的内在稳定性,从而抑制 RNAi 作用;连续 4个以上的 U 和 A 可能终止由 RNA Polymerase III 介导的转录。siRNA 序列中的重复序列或回文结构可能形成发夹状结构,这种结构的存在可以降低 siRNA 的有效浓度和沉默效率。


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