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针对circRNA的接头序列设计siRNA序列特异性敲低目的circRNA的表达，对于每条选定的siRNA靶序列，设计正义链和反义链，以 loop（9nt or 10nt）相连，构建shRNA质粒直接转染或通过病毒包装后转染细胞，并对转染细胞进行阳性鉴定和转代细胞株的培养，最终实现对特定circRNA特异性敲低的作用。

针对circRNA circPAIP2进行siRNA敲低实验示意图

技术优势

1. shRNA载体转染效率高、操作简单、RNA沉默效果易于检测；

2. 设计circRNA Divergent primers检测敲低circRNA的效率；

3. 特异性敲低circRNA的表达，不影响亲本线性基因的表达。

客户提供

1. mRNA/lncRNA需要提供基因名称（ID号）、种属；

2. circRNA需要提供基因名称（ID号）或者完整序列、种属。

交付标准

1. shRNA质粒（3+1套餐，3个无敲低效果，免费加做一个）：2 μg质粒+200 μL甘油菌；

2. 对照质粒：2 μg质粒+200 μL甘油菌；

3. 载体构建报告；

4. 筛选验证报告（细胞转染+qPCR检测）。

qPCR检测结果

表1 NNN细胞中has_circ_000XXXX相对表达差异

Sample name	GAPDH Average CT	hsa_circ_000XXXX Average CT	2-ΔΔCT1	2-ΔΔCT2	2-ΔΔCT3	Average 2-ΔΔCT±SD	SEM
NNN-control	13.87±0.12	25.66±0.09	1.07	0.98	0.96	1±0.06	0.03
NNN-si-NC	13.9±0.07	25.68±0.1	1.03	1.06	0.93	1.01±0.07	0.04
NNN-si-1	13.83±0.11	26.36±0.08	0.56	0.6	0.63	0.6±0.03	0.02
NNN-si-2	13.79±0.16	26.53±0.05	0.5	0.51	0.54	0.52±0.02	0.01
NNN-si-3	13.84±0.08	27.21±0.08	0.33	0.36	0.32	0.34±0.02	0.01

图1 NNN细胞中has_circ_000XXXX相对表达差异

1. circRNA 的沉默（干扰）怎么做？

基于RNAi技术对基因进行沉默，实验中一般设计合成靶标基因的siRNA，瞬转细胞后进行RT-PCR检测。

外显子来源的circRNA因为和mRNA有同样的外显子序列，在序列内部设计siRNA靶标无法保证特异性，因此只能针对junction位点处设计靶标序列，前后移动范围有限，siRNA通常很难设计。EiciRNA或者内含子来源的环形RNA，除了针对junction位点处设计靶标外，也可以尝试在内含子序列上设计。

2. 设计siRNA为什么不能连续G\C超过3个，连续A\T超过4个？

因为连续 3个以上的 G 和 C 可以降低双链 RNA 的内在稳定性，从而抑制 RNAi 作用；连续 4个以上的 U 和 A 可能终止由 RNA Polymerase III 介导的转录。siRNA 序列中的重复序列或回文结构可能形成发夹状结构，这种结构的存在可以降低 siRNA 的有效浓度和沉默效率。