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RNA m6A甲基化测序 | MeRIP-Seq
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常见问题


        m6A(N6-methyladenosine,6-甲基腺苷)是真核生物中最常见最丰富的RNA修饰,作为一种可逆修饰,RNA既可以在甲基化转移酶METTL3/14 等酶的作用下发生m6A甲基化修饰,又可以在FTO、ALKBH5等酶的作用下发生去甲基化修饰;另外,它能够通过YTHDC1/2 等m6A 识别因子发挥重要功能,例如目前已发现 m6A 在调控基因表达、剪接、RNA编辑、RNA稳定性、控制mRNA寿命和降解、介导环状RNA翻译等方面扮演重要角色。

        circRNA 作为一类新的 RNA 分子,也被发现存在大量 m6A 修饰,并且与线性 RNA 共享相同的 Writers 和 Readers 但具有不同的表达模式。m6A 对 circRNA 的生命活动具有重要的调控功能,包括m6A 能够介导 circRNA 的形成。

        目前对m6A的转录组研究的主要方法为MeRIP-seq(methylated RNA immunoprecipitation sequencing),其原理是通过m6A特异性抗体识别并结合具有m6A修饰的RNA片段进行免疫共沉淀,对富集下来的RNA片段进行高通量测序。结合生物信息学分析,即可在全转录组范围内对m6A修饰进行系统研究。

技术路线


测序方案

上机平台 Illumina Novaseq 6000

测序模式 PE150

测序数据量 12Gb raw data



案例1


案例2








生物信息分析


基础分析

测序数据质量评估(碱基质量评估,序列质量评估)

比对结果质控

基因覆盖度分析

m6A peaks 识别

m6A peaks 特征注释

m6A mRNA 分析

甲基化mRNA的motif分析

m6A lncRNA 分析

甲基化lncRNA的motif分析

circRNA 识别鉴定分析

circRNA的m6A富集分析

甲基化circRNA的motif分析


高级分析(有不同处理条件分组样本)

甲基化基因的差异表达分析

差异甲基化基因GO功能富集分析

差异甲基化基因KEGG通路分析

差异甲基化基因reactome通路分析

甲基化lncRNA的差异表达分析

差异甲基化lncRNA的顺式编码基因的GO功能富集分析

差异甲基化lncRNA的顺式编码基因的KEGG通路分析

差异甲基化lncRNA的顺式编码基因的Reactome通路分析

甲基化circRNA的差异表达分析

差异甲基化circRNA宿主基因的GO功能富集分析

差异甲基化circRNA宿主基因的KEGG通路分析

差异甲基化circRNA宿主基因的Reactome通路分析


个性化分析

与转录组关联分析(需有2组样本,如实验组和对照组)

关联分析四象限图

部分结果展示

Figure1. RIP 富集分布分析

Figure2. m6A基因组特征分布分析

Figure3. m6A 全基因组分布分析


Figure4. m6A的元基因分析


Figure5. m6A 特定基因丰度展示


Figure6. KEGG通路富集分析


Figure7. Motif分析


Figure8. 转录组联合分析四象限图




Table.MeRIP-Seq原始样本送样建议

送样类型

送样量

备注

细胞 (细胞数)

≥5*10^7

无支原体污染

动物组织

≥300mg


植物组织

≥300mg


Table.MeRIP-Seq RNA样本送样建议

送样类型

送样量

完整性(RIN值)

浓度

纯度

total RNA

≥200μg

≥7

≥100ng/ul

无DNA,蛋白/盐离子等污染,样本无色透明不粘稠


*更具体的送样方法请详询销售或技术支持

物种范围:人、小鼠、大鼠等哺乳动物,其他物种请咨询销售或技术支持


Q1:做MeRIP-seq是否还需要另外做普通的转录组测序?

A1:不需要,Input数据即可作为普通全转录组测序数据进行分析。


Q2:为什么MeRIP-seq需要同时测Input和IP样本?

A2:MeRIP-seq实验设置中Input和IP组成一对样品。实验环节IP样品用m6A抗体特异性富集甲基化修饰的RNA片段,而Input仅仅是片段化的RNA则作为对照消减背景噪音,在建库、测序平行开展。结合峰检测分析需整合两个样本的数据,并利用Input数据排除本底表达水平高或非特异性结合的peaks,以提高calling peak的准确性。


Q3:开展MeRIP-seq是否有物种限制?

A3:如不是人、小鼠和大鼠的物种建议先进行咨询。一般有参考基因组,且基因组拼接至染色体水平,gtf注释文件较完整的物种都可以开展;真核、原核或病毒在结合峰检测涉及的软件和参数存在差别,原核或病毒项目建议先评估。


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