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核糖体印迹测序 | Ribo-seq
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常见问题

广义的翻译组指的是直接参与翻译过程的所有元件,包括但不限于核糖体、正在翻译的mRNA、调控性RNA、新生肽链及各种翻译因子等;狭义的翻译组特指正在翻译的mRNA。核糖体印迹测序(ribosome profiling,或ribo-seq)是指对被核糖体保护的30nt左右的mRNA片段进行深度测序分析,是目前研究翻译组学的主要技术手段之一。

技术路线


Ribo-seq实验及分析思路

测序方案

测序平台 Illumina Novaseq 6000

测序模式 PE150

测序数据量 100M raw reads





人类心脏翻译组学研究

The Translational Landscape of the Human Heart

Cell (2019). DOI: 10.1016/j.cell.2019.05.010(IF:36.216

测序策略:Ribo-seq & mRNA-seq

样本分组:80例心脏组织,65例心肌病,15例正常对照


本研究对65例扩张性心肌病(DCM)患者左心室心肌组织和15例正常对照者的左心室心肌组织进行mRNA测序(mRNA-seq)及核糖体印迹测序(ribo-seq),分析了DCM与健康对照组被翻译的RNA分子总体情况,结合之前一项心脏组织蛋白质组学的数据,系统分析了左心室心肌组织中被翻译的ORF和对应的蛋白或多肽的总体信息。共发现1090个uORF、 20763个传统的ORF以及74个dORF。还包括了来自于169个lncRNA 的339个sORF(图1)。此外,本文通过分析ribo-seq数据中被核糖体捕获的circRNA接口序列找到了40个可翻译的circRNA分子。作者分析接口位置Reads的条件是不少于9nt的跨接口碱基,在不少于3个样本且总Reads数不少于5个的才算有效的可翻译circRNA(图2)。这40个circRNA来自39个基因,其中有6个circRNA的翻译产物在早期的蛋白质组学研究中有对应的质谱线索。40个circRNA中也不乏大家耳熟能详的明星分子,包括CDR1as等等。其中circCFLAR,circSLC8A1,circMYBPC3和circRYR2是首次发现的心肌中可被翻译的circRNA分子。


Figure1. 心脏翻译组学研究概览


Figure2. Ribo profiling分析可翻译的circRNA分子



生物信息分析内容

基础分析

原始数据质控检查(碱基质量评估,序列质量评估)

比对结果质控

reads 在基因组上的分布分析

基因覆盖度分析

翻译图谱刻画:P-site定义确认

翻译图谱刻画:ORFs统计与对应的氨基酸序列分析

高级分析(有不同处理条件分组样本)

翻译组差异基因表达分析

翻译组差异基因GO功能分析

翻译组差异基因KEGG通路分析

翻译组差异基因Rectome通路分析

circRNA翻译事件识别分析

翻译组差异circRNA宿主基因GO功能分析

翻译组差异circRNA宿主基因KEGG通路分析

翻译组差异circRNA宿主基因Rectome通路分析

翻译组差异circRNA的靶向miRNA预测分析

翻译组差异circRNA及靶向miRNA网络调控制图

差异circRNA翻译潜能预测分析(CPAT预测,IRES预测和ORF预测)

个性化分析(需要同时做RNA-seq,结合RNA-seq数据分析)

TE翻译效率分析

差异TE基因表达分析

差异TE基因聚类分析

差异TE基因GO/KEGG富集分析


部分结果展示

Figure1. P-site 评估样图

Figure2. ORF类型数量统计图


Figure3. Riboseq差异表达基因的火山图








Table1. Ribo-seq原始样本送样建议

送样类型

送样量

备注

细胞 (细胞数)

≥1*10^7

无支原体污染

动物组织

≥200mg


植物组织

≥200mg



*翻译组测序的细胞样本处理方法和转录组测序不一样,具体处理、保存和运输方法请咨询技术支持。

物种范围:人、小鼠、大鼠,其他物种请详询销售或技术支持







Q1:为什么Trizol裂解的细胞不能做翻译组测序?

A1:翻译组测序实验是从细胞或组织开始的,而不是从总RNA开始的。为获取体内核糖体结合mRNA的真实情况,通常在裂解细胞前,会使用Cycloheximide(放线菌酮)来抑制翻译延伸。如果没有用专用的裂解液而是用Trizol裂解细胞,trizol会破坏核糖体和RNA结合的状态,无法获得RFPs,翻译组测序也就做不了。


Q2:只做Riboseq,不做RNA-seq可以分析翻译效率吗?

A2:不可以

翻译效率TE的计算ORF 序列长度标准化后的核糖体捕获片段数目 / 转录本序列长度标准化后的RNA-seq 片段数

如果没有转录组测序的数据,无法进行计算。


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