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核糖体-新生肽链复合物测序 | RNC-seq
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核糖体-新生肽链复合物测序(Ribosome Nascent-chain Complex sequencing,RNC-seq)是指对与核糖体结合的正在翻译的全长RNA进行测序,是除了ribo-seq外另一种常用的翻译组学研究技术。

RNC-seq可以进一步深化转录组研究,直接在翻译水平对应生物表型,可知哪些基因正在翻译,以及翻译起始效率;可通过翻译机制研究弥补转录组测序差异表达基因过多或过少的问题;同时也可以分析来源于circRNA或lncRNA的ORF,预测可能翻译的circRNA,且较之 Ribo-seq 捕获的短片段具有更高的灵敏度,能更容易获得 circRNA 的信号。

技术路线

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测序方案

测序平台 Illumina Novaseq 6000

测序模式 PE150
测序数据量 10Gb raw data

A peptide encoded by circular form of LINC-PINT suppresses oncogenic transcriptional elongation in glioblastoma

NATURE COMMUNICATIONS(2018),DOI: 10.1038/s41467-018-06862-2

测序策略:RNA-seq + RNC-seq


该研究对人的正常细胞和胶质瘤细胞分别进行转录组测序(RNA-seq)及翻译组测序(RNC-seq),通过测序数据分析,总共识别了15189个circRNA分子,其中7017个来自RNA-seq数据,12863个来自RNC-seq数据。对两组样本数据中显著差异表达的circRNA分子取交集,初步筛选出了320个circRNA分子(图1)。由于大部分circRNA的CDS区域与其编码蛋白的母基因相同,为了排除假阳性数据的干扰,研究团队主要关注来源于非编码基因的10个候选circRNA分子。进一步通过蛋白编码能力预测发现了5个具有蛋白编码能力的circRNA分子。最终研究团队选择来源于LINC-PINT基因的circRNA进行后续研究。该circRNA可以编码一个87个氨基酸的多肽(图2),这个多肽可直接与聚合酶相关因子复合物(PAF1c)相互作用,抑制多癌基因的转录延伸。该多肽及其相应的circRNA表达水平在胶质母细胞瘤中较正常组织降低。研究结果证实了circRNA编码的肽段的存在及其在胶质母细胞瘤发生发展中的潜在功能。


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Figure1. 两种测序显著差异表达的circRNA分子取交集


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Figure2. 特异性抗体IP实验及LC-MS/MS分析鉴定PINT87aa多肽序列


生信分析内容结果

基础分析

原始数据质控检查(碱基质量评估,序列质量评估)

比对结果质控检查

基因覆盖度分析

基于基因表达的样品主成分分析

基因表达分析

差异基因表达分析

差异基因GO功能分析

差异基因KEGG通路分析

差异基因Rectome通路分析

GSEA分析(针对mRNA基因)

circRNA预测及鉴定

circRNA差异分析

差异circRNA宿主基因的GO功能分析

差异circRNA宿主基因的KEGG通路分析

差异circRNA宿主基因的Rectome通路分析

差异circRNA的靶向miRNA预测分析

差异circRNA及靶向miRNA网络调控制图

长链非编码RNA的识别

长链非编码RNA差异分析

差异lncRNA顺式调控基因的GO功能分析

差异lncRNA顺式调控基因的KEGG通路分析

差异lncRNA顺式调控基因的Rectome通路分析

高级分析

circRNA翻译潜能预测分析(CPAT预测,IRES预测和ORF预测)

翻译效率分析(需要同时做RNA-seq,结合RNA-seq数据分析)

*可选择只测circRNA的方法步骤进行实验,详询技术支持


部分结果展示

Figure1. RNC-seq差异表达基因热图展示


Figure2. RNC-seq差异表达circRNA的KEGG通路富集图展示


Figure3. RNC-seq的circRNA-miRNA网络图展示





Table1. RNC-seq原始样本送样建议

送样类型

送样量

备注

细胞 (细胞数)

≥1*10^7

无支原体污染

动物组织

≥100mg


植物组织

≥100mg



*翻译组测序的细胞样本处理方法和转录组测序不一样,具体处理、保存和运输方法请咨询技术支持。

物种范围:人、小鼠、大鼠,其他物种请详询销售或技术支持


Q1:为什么Trizol裂解的细胞不能做翻译组测序?

A1:翻译组测序实验是从细胞或组织开始的,而不是从总RNA开始的。为获取体内核糖体结合mRNA的真实情况,通常在裂解细胞前,会使用Cycloheximide(放线菌酮)来抑制翻译延伸。如果没有用专用的裂解液而是用Trizol裂解细胞,trizol会破坏核糖体和RNA结合的状态,无法获得RFPs,翻译组测序也就做不了。


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