circRNA qPCR引物设计circRNA qPCR检测circRNA表达分析circRNA过表达实验circRNA干扰实验细胞功能实验慢病毒包装circRNA功能分析T系列-circRNA翻译验证R系列-IRES活性检测circRNA翻译-验证研究circRNA注释及功能预测circRNA荧光素酶报告检测circRNA RIP实验circRNA pull-down实验circRNA相互作用组学研究circRNA FISH探针合成circRNA定位分析circRNA全长纳米孔测序 | ONT circRNA full-length Sequencin三代测序全转录组测序 | RNA-seqcircRNA测序 | circRNA-seqmRNA测序 | mRNA-seq小RNA测序 | miRNA-seq转录组学研究核糖体印迹测序 | Ribo-seq核糖体-新生肽链复合物测序 | RNC-seq翻译组学研究RNA m6A甲基化测序 | MeRIP-Seq染色质开放性测序 | ATAC-seq表观组学研究10×Visium空间转录组测序空间转录组学研究外泌体RNA测序 | Exosome RNA-seq外泌体提取及鉴定外泌体研究RNA免疫共沉淀测序 | RIP-seq染色质免疫共沉淀测序 | ChIP-seq核酸蛋白互作研究微生物宏基因组测序 | Metagenomics Sequencing基因组学研究生物医学大数据挖掘分析circRNA定制化分析及绘图常规组学及多组学联合分析单细胞测序数据生信分析生物信息学分析服务RNase RcircRNA qRT-PCR试剂盒circRNA检测circRNA过表达系列circRNA过表达载体系列血液基因组DNA提取试剂盒全血RNA提取试剂盒细胞RNA提取试剂盒核酸提取与纯化RNA pull-down试剂盒RIP试剂盒T7转录试剂盒(生物素标记)分子互作系列外泌体提取试剂盒Taqman探针法支原体检测试剂盒(UNG防污染版)支原体检测核糖体RNA去除试剂盒(人/大鼠/小鼠)核糖体RNA去除试剂盒(植物)RNA-seq文库构建试剂盒RNA建库接头试剂DNA磁珠RNA磁珠高通量测序系列circRNA标准品系列CircLucT7耐高温高产量RNA合成试剂盒环状RNA合成试剂盒T4 RNA连接酶1T4 RNA连接酶2circRNA制备系列原位杂交系列原位杂交系列
circRNA RIP实验
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RNA免疫沉淀(RIP)运用针对目标蛋白质的抗体把相应的RNA-蛋白质复合物沉淀下来,经过分离纯化并对结合在复合物上的RNA进行测序或PCR分析。RIP可应用于研究miRNA调节靶点、RNARNPRNA结合蛋白)的互作关系等。

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RIP技术原理

客户提供

1. 新鲜细胞/组织样本(组织≥100mg,细胞不少于1E+7个)细胞保证无支原体污染;

2. IP级别抗体和抗体信息

3. qPCR检测基因信息:物种、基因名称、长度和序列等,指定具体转录本(例如NCBI编号NM_001126113.2);

4. circRNA:名称(ID)、长度、序列、物种

5. RIP产物检测项目。


交付标准

1. RIP实验报告(方法、流程,结果);

2. RIP剩余产物。

RIP实验的目的是分析与目的蛋白结合的RNA,原理则是运用针对目的蛋白的抗体把相应的RNA-蛋白复合物沉淀下来,经过分离纯化并对结合在复合物上的RNA进行测序或PCR分析。

2016年9月23日,意大利Maria R. Matarazzo教授在Methods in Molecular Biology杂志介绍了RIP实验的经典操作方法。文中介绍的RIP实验操作流程如下图所示:



图1 经典RIP实验操作流程(来自[1])


        而RIP实验有哪些应用呢?大家都知道RNA是一种不稳定的生物大分子,绝大多数RNA都需要与特定的RNA结合蛋白形成RNA-蛋白复合物才能稳定存在于细胞中。RNA-蛋白复合物驱动了几乎所有细胞过程的基因表达的转录后调控,包括剪接(splicing)、出核转运(nuclear export)、mRNA稳定性以及蛋白转译过程。因此,对基因调控的了解就有赖于确定这些过程中RNA的结合的变化,RIP技术应运而生,可应用于研究miRNA调节靶点、RNA与RNP(RNA结合蛋白)的互作关系等。


案例1

RIP用于研究circRNA与蛋白互作


        2022年3月29号,重庆医科大学的陈俊霞教授在Mol Cancer发表文章Hypoxia-induced circWSB1 promotes breast cancer progression through destabilizing p53 by interacting with USP10,本研究揭示了一种新的机制,即缺氧诱导的circWSB1可以与USP10相互作用,从而减弱USP10介导的p53稳定并促进BC的进展,为BC提供了一种替代的预后生物标记物和治疗靶点。

已有报道发现,环状RNA通过miRNA海绵机制参与缺氧的调控。几乎所有这些与缺氧相关的circRNA都起到了miRNA海绵的作用,环状RNA同样可以通过结合蛋白以及翻译多肽发挥功能。作者使用pull-down对环状RNA的结合产物进行分析,虽然没有发现P53,但是作者发现泛素化酶USP10与circWBS1相互结合。使用数据库对二者的结合位点进行了预测。设计USP10的全长和缺失突变体并插入Flag标签(图2),通过RIP实验(使用吉赛生物RIP试剂盒)对USP10与circWBS1的结合进行了验证。


案例2

RIP用于研究lncRNA与蛋白互作



图4 lncRNA和编码RNA与EZH2结合能力的比较(来自[3])


        在本研究中,使用EZH2特异性抗体对人胃癌细胞系MKN45和AGS,以及对照细胞系GES-1进行RIP-seq,分析了8256个与EZH2相关的RNAs,包括编码和非编码RNAs,其中MALAT1在MKN45细胞系中高表达。并且发现MALAT1通过和EZH2相互作用,抑制原钙黏蛋白因子10(PCDH10)的表达,从而促进胃癌细胞的侵袭和转移[3]。


案例3

RIP用于研究miRNA与蛋白互作



图5 缺铁性和非缺血性NPCs中isomiRs分析(来自[4])


        在本研究中,利用Ago2 RIP-seq,分析非缺血性和缺血性成年大鼠侧脑室下区(SVZ)的神经祖细胞(NPCs)miRNAs的表达情况[4]。

        结果显示,相较于非缺血性NPCs,中风改变了NPCs中Ago2相关的miRNAs表达,缺血性NPCs中的isomiRsreads数增加,其中5'末端添加核苷酸的isomiR-142-5p_L+2R-1显著上调,5'末端缺失核苷酸的isomiR-187-5p_L-2R+3显著下调[4]。



参考文献

1. RIP: RNA Immunoprecipitation. Methods Mol Biol, 2016. 1480: p. 73-86.

2.Hypoxia-induced circWSB1 promotes breast cancer progression through destabilizing p53 by interacting with USP10[J].   Molecular Cancer, 2022, 21(1):1-20.

3. MALAT1 long ncRNA promotes gastric cancer metastasis by suppressing PCDH10.Oncotarget. 2016 Mar 15; 7(11): 12693–12703.

4. Identification of miRNomes associated with adult neurogenesis after stroke using Argonaute 2-based RNA sequencing.RNA Biol. 2017; 14(5): 488–499.




以anti-SNRNP70为目的抗体,anti-IgG为对照抗体,在Hela细胞裂解样本中,进行免疫沉淀。免疫沉淀所得蛋白质样品,进行Western blot检测,input样本与目的样本在约70KDa大小位置有明显条带,阴性对照样本无条带。

        免疫沉淀所得RNA以U1 snRNA特异性引物,进行RT-PCR分析,input样本与目的样本可见明显的PCR产物,指示SNRNP70富集U1 snRNA。


Western blot检测SNRNP70:


PCR检测U1 snRNA:









1. RIP送样里细胞需要量是1E7的细胞量,是必须要达到1✖10的7次方的细胞量吗?

我们推荐用7次方进行,这种内源结合本来就只能结合少量的蛋白和RNA,如果最开始的细胞量少,结合下来的物质可能会更少。


2.RIP实验产物能否进行去线性,进行circRNA建库?

如果客户RIP捕获前已经打断了RNA,这直接可以判断,不能去线性

如果捕获产物中RNA的片段化程度比较高,不建议用去线性的方法测circRNA。

一般RIP测序,都是建议用去rRNA链特异的方面进行建库测序。


3.RIP结果WB检测正常,Input、IP、Igg三组ct值几乎无差异说明什么?

说明目的蛋白与检测基因无特异性结合。


4.为什么RIP实验前要做WB预实验评估?

做WB预实验主要目的:

① 检测抗体的特异性,是否能结合目的蛋白;

② 检测样本中目的蛋白是否有表达及丰度水平;

③ 总之,检测该样本能否满足做RIP实验的最基本条件。

④ RIP预实验做的是WB检测,跟我们平常理解的预实验不太一样,这是探索性实验,预实验的目的是检测这个实验的基本条件。


5. 我的抗体做WB都有目的蛋白条带的,为啥做RIP就没条带了?

免疫试验有很多,但实验目的不一样,例如WB、ELISA、IP、IF、ChIP、IHC(P)、FACS,其中只有WB是一种需要将蛋白质变性的实验,用强烈的蛋白变性剂SDS和β巯基乙醇,将蛋白质的三维结构全部抹去,这种情况下任何一种该蛋白的抗体都能识别WB实验中变成直线状态的抗原;但能做WB的抗体就不一定能用来做非变性试验IP、IF、IHC了,因为天然蛋白的三维结构隐藏了很多抗体结合位点,WB级别的抗体无法与之结合。做RIP实验,需要选购IP级别的抗体。


6. 在RIP实验中,为什么IP和WB使用的抗体需要来源于不同的种属?

在RIP实验中,IP和WB使用的抗体需要来源于不同的种属,否者在跑WB时,会在55KD和25KD的位置出现较强的重链和轻链,影响目的蛋白的曝光。


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