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circRNA RIP实验
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RNA免疫沉淀(RIP)运用针对目标蛋白质的抗体把相应的RNA-蛋白质复合物沉淀下来,经过分离纯化并对结合在复合物上的RNA进行测序或PCR分析。RIP可应用于研究miRNA调节靶点、RNARNPRNA结合蛋白)的互作关系等。

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RIP技术原理

客户提供

1. 新鲜细胞/组织样本(组织≥100mg,细胞不少于1E+7个)细胞保证无支原体污染;

2. IP级别抗体和抗体信息

3. qPCR检测基因信息:物种、基因名称、长度和序列等,指定具体转录本(例如NCBI编号NM_001126113.2);

4. circRNA:名称(ID)、长度、序列、物种

5. RIP产物检测项目。


交付标准

1. RIP实验报告(方法、流程,结果);

2. RIP剩余产物。

RIP实验的目的是分析与目的蛋白结合的RNA,原理则是运用针对目的蛋白的抗体把相应的RNA-蛋白复合物沉淀下来,经过分离纯化并对结合在复合物上的RNA进行测序或PCR分析。

2016年9月23日,意大利Maria R. Matarazzo教授在Methods in Molecular Biology杂志介绍了RIP实验的经典操作方法。文中介绍的RIP实验操作流程如下图所示:



图1 经典RIP实验操作流程(来自[1])


        而RIP实验有哪些应用呢?大家都知道RNA是一种不稳定的生物大分子,绝大多数RNA都需要与特定的RNA结合蛋白形成RNA-蛋白复合物才能稳定存在于细胞中。RNA-蛋白复合物驱动了几乎所有细胞过程的基因表达的转录后调控,包括剪接(splicing)、出核转运(nuclear export)、mRNA稳定性以及蛋白转译过程。因此,对基因调控的了解就有赖于确定这些过程中RNA的结合的变化,RIP技术应运而生,可应用于研究miRNA调节靶点、RNA与RNP(RNA结合蛋白)的互作关系等。


案例1

RIP用于研究circRNA与蛋白互作


        2022年3月29号,重庆医科大学的陈俊霞教授在Mol Cancer发表文章Hypoxia-induced circWSB1 promotes breast cancer progression through destabilizing p53 by interacting with USP10,本研究揭示了一种新的机制,即缺氧诱导的circWSB1可以与USP10相互作用,从而减弱USP10介导的p53稳定并促进BC的进展,为BC提供了一种替代的预后生物标记物和治疗靶点。

已有报道发现,环状RNA通过miRNA海绵机制参与缺氧的调控。几乎所有这些与缺氧相关的circRNA都起到了miRNA海绵的作用,环状RNA同样可以通过结合蛋白以及翻译多肽发挥功能。作者使用pull-down对环状RNA的结合产物进行分析,虽然没有发现P53,但是作者发现泛素化酶USP10与circWBS1相互结合。使用数据库对二者的结合位点进行了预测。设计USP10的全长和缺失突变体并插入Flag标签(图2),通过RIP实验(使用吉赛生物RIP试剂盒)对USP10与circWBS1的结合进行了验证。


案例2

RIP用于研究lncRNA与蛋白互作



图4 lncRNA和编码RNA与EZH2结合能力的比较(来自[3])


        在本研究中,使用EZH2特异性抗体对人胃癌细胞系MKN45和AGS,以及对照细胞系GES-1进行RIP-seq,分析了8256个与EZH2相关的RNAs,包括编码和非编码RNAs,其中MALAT1在MKN45细胞系中高表达。并且发现MALAT1通过和EZH2相互作用,抑制原钙黏蛋白因子10(PCDH10)的表达,从而促进胃癌细胞的侵袭和转移[3]。


案例3

RIP用于研究miRNA与蛋白互作



图5 缺铁性和非缺血性NPCs中isomiRs分析(来自[4])


        在本研究中,利用Ago2 RIP-seq,分析非缺血性和缺血性成年大鼠侧脑室下区(SVZ)的神经祖细胞(NPCs)miRNAs的表达情况[4]。

        结果显示,相较于非缺血性NPCs,中风改变了NPCs中Ago2相关的miRNAs表达,缺血性NPCs中的isomiRsreads数增加,其中5'末端添加核苷酸的isomiR-142-5p_L+2R-1显著上调,5'末端缺失核苷酸的isomiR-187-5p_L-2R+3显著下调[4]。



参考文献

1. RIP: RNA Immunoprecipitation. Methods Mol Biol, 2016. 1480: p. 73-86.

2.Hypoxia-induced circWSB1 promotes breast cancer progression through destabilizing p53 by interacting with USP10[J].   Molecular Cancer, 2022, 21(1):1-20.

3. MALAT1 long ncRNA promotes gastric cancer metastasis by suppressing PCDH10.Oncotarget. 2016 Mar 15; 7(11): 12693–12703.

4. Identification of miRNomes associated with adult neurogenesis after stroke using Argonaute 2-based RNA sequencing.RNA Biol. 2017; 14(5): 488–499.




以anti-SNRNP70为目的抗体,anti-IgG为对照抗体,在Hela细胞裂解样本中,进行免疫沉淀。免疫沉淀所得蛋白质样品,进行Western blot检测,input样本与目的样本在约70KDa大小位置有明显条带,阴性对照样本无条带。

        免疫沉淀所得RNA以U1 snRNA特异性引物,进行RT-PCR分析,input样本与目的样本可见明显的PCR产物,指示SNRNP70富集U1 snRNA。


Western blot检测SNRNP70:


PCR检测U1 snRNA:









1. RIP送样里细胞需要量是1E7的细胞量,是必须要达到1✖10的7次方的细胞量吗?

我们推荐用7次方进行,这种内源结合本来就只能结合少量的蛋白和RNA,如果最开始的细胞量少,结合下来的物质可能会更少。


2.RIP实验产物能否进行去线性,进行circRNA建库?

如果客户RIP捕获前已经打断了RNA,这直接可以判断,不能去线性

如果捕获产物中RNA的片段化程度比较高,不建议用去线性的方法测circRNA。

一般RIP测序,都是建议用去rRNA链特异的方面进行建库测序。


3.RIP结果WB检测正常,Input、IP、Igg三组ct值几乎无差异说明什么?

说明目的蛋白与检测基因无特异性结合。


4.为什么RIP实验前要做WB预实验评估?

做WB预实验主要目的:

① 检测抗体的特异性,是否能结合目的蛋白;

② 检测样本中目的蛋白是否有表达及丰度水平;

③ 总之,检测该样本能否满足做RIP实验的最基本条件。

④ RIP预实验做的是WB检测,跟我们平常理解的预实验不太一样,这是探索性实验,预实验的目的是检测这个实验的基本条件。


5. 我的抗体做WB都有目的蛋白条带的,为啥做RIP就没条带了?

免疫试验有很多,但实验目的不一样,例如WB、ELISA、IP、IF、ChIP、IHC(P)、FACS,其中只有WB是一种需要将蛋白质变性的实验,用强烈的蛋白变性剂SDS和β巯基乙醇,将蛋白质的三维结构全部抹去,这种情况下任何一种该蛋白的抗体都能识别WB实验中变成直线状态的抗原;但能做WB的抗体就不一定能用来做非变性试验IP、IF、IHC了,因为天然蛋白的三维结构隐藏了很多抗体结合位点,WB级别的抗体无法与之结合。做RIP实验,需要选购IP级别的抗体。


6. 在RIP实验中,为什么IP和WB使用的抗体需要来源于不同的种属?

在RIP实验中,IP和WB使用的抗体需要来源于不同的种属,否者在跑WB时,会在55KD和25KD的位置出现较强的重链和轻链,影响目的蛋白的曝光。


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