circRNA技术服务
高通量测序服务
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RNA pull-down是检测RNA结合蛋白与其靶RNA之间相互作用的主要实验手段之一。目前常用的两类技术,线性RNA替代法与探针钓取法,对同源性较高或表达丰度较低的circRNA并不适用。吉赛生物新一代circRNA pull-down技术,可对大部分circRNA实现高效率、强特异性的捕获。 circRNA pull-down技术原理
实验流程 circRNA pull-down实验流程 实验分组 circRNA pull-down实验分组
技术优势 1. 实验体系捕获的是环形的circRNA分子,相对“线性RNA替代法”可信度更高; 2. 通过circRNA过表达载体引入外源标签,可降低来源基因的背景干扰; 3. circRNA标签与捕获蛋白间的相互作用远远强于探针分子的捕获作用,特异性更高; 4. circRNA标签的插入位置可灵活设计,能有效避免竞争性探针导致的junction位置互作分子信息丢失问题; 5. 不依赖于细胞内本底表达的circRNA量,对细胞内表达丰度低的circRNA同样适用。
客户提供 1. circRNA名称(ID)、长度、序列、物种; 2. 指定载体名称; 3. 实验目的; 4. 预测结合位点信息; 5. 细胞和细胞相关信息。
交付标准 1. 详细的circRNA pull-down完整实验报告(包含载体构建、诱导表达、pull-down富集等); 2. 带标签过表达质粒、不带标签过表达质粒、对照质粒(赠送)等; 3. 额外赠送(以下情况任选一): ① 质谱检测2个样本; ② pulldown产物2个以内WB检测; ③ pulldown产物3个以内miRNA qPCR检测。 1、circRNA pull-down技术在circRNA与蛋白间相互作用研究中的应用 在2016年Nature Communication杂志上发表了一篇关于circANRIL在动脉粥样硬化这一疾病中功能研究的文章中[1],作者使用了RNA标签BoxB对circANRIL进行了标记,在工具细胞293T中进行pull-down实验。 作者对pull-down获得的蛋白进行质谱分析,结果显示,circANRIL结合蛋白中有38%与核糖体的形成有关,16%的蛋白参与了细胞内RNA的剪切调控[1] 。 这一结果为作者的后续研究提供了重要的指示,预测circANRIL与核糖体RNA形成可能存在密切关系,同时也是一个强有力的证据。 circANRIL pull-down获得的蛋白质谱分析[1] 2、circRNA pull-down技术在circRNA与miRNA间相互作用研究中的应用 2017年Journal of Experimental & Clinical Cancer Research杂志上发表的文章中,作者使用了MS2序列作为circRNA标签,在不同的乳腺癌肿瘤细胞中研究circRNA sponge功能。 作者在circGFRA1中引入了MS2序列标签,分别在MDA-MB-231、MDA-MB-486和BT549 这3株三阴性乳腺癌细胞中进行了pull-down,对circGFRA1进行富集,发现在circGFRA1富集产物中miR-34a也存在明显的富集情况[2]。随后一系列的实验结果证明,circGFRA1通过吸附miR-34a对其下游基因的表达进行调控,从而实现对肿瘤细胞增殖的促进作用。 circGFRA1富集产物中与miR-34a也存在明显的富集情况[2] 参考文献 1. Holdt, L.M., et al., Circular non-coding RNA ANRIL modulates ribosomal RNA maturation and atherosclerosis in humans. Nat Commun, 2016. 7; 12429. 2. He, R., et al., circGFRA1 and GFRA1 act as ceRNAs in triple negative breast cancer by regulating miR-34a. J Exp Clin Cancer Res, 2017.10;36(1): 145. 3. Jian X, He H, Zhu J, et al. Hsa_circ_001680 affects the proliferation and migration of CRC and mediates its chemoresistance by regulating BMI1 through miR-340. Mol Cancer. 2020 01;19(1):20. 通过pull-down实验将MS2-CP-MS2-circRNA复合物拉下来,WB检测MS2-CP蛋白,RT-qPCR检测目的circRNA的富集程度。 pull-down样品分组
WB检测结果 图5 pull-down 前后样本WB检测结果(Flag抗体) 1~8组分别对应pull-down实验分组样品编号 RT-qPCR验证pull-down富集效果 qPCR产物检测hsa_circ_00AAAAA富集倍数
图2 pull-down产物检测hsa_circ_00AAAAA富集倍数 1~8组分别对应pull-down实验分组样品编号 |