1、circRNA pull-down技术在circRNA与蛋白间相互作用研究中的应用

        在2016年Nature Communication杂志上发表了一篇关于circANRIL在动脉粥样硬化这一疾病中功能研究的文章中[1]，作者使用了RNA标签BoxB对circANRIL进行了标记，在工具细胞293T中进行pull-down实验。

        作者对pull-down获得的蛋白进行质谱分析，结果显示，circANRIL结合蛋白中有38%与核糖体的形成有关，16%的蛋白参与了细胞内RNA的剪切调控[1] 。

        这一结果为作者的后续研究提供了重要的指示，预测circANRIL与核糖体RNA形成可能存在密切关系，同时也是一个强有力的证据。

circANRIL pull-down获得的蛋白质谱分析[1]

2、circRNA pull-down技术在circRNA与miRNA间相互作用研究中的应用

        2017年Journal of Experimental & Clinical Cancer Research杂志上发表的文章中，作者使用了MS2序列作为circRNA标签，在不同的乳腺癌肿瘤细胞中研究circRNA sponge功能。

        作者在circGFRA1中引入了MS2序列标签，分别在MDA-MB-231、MDA-MB-486和BT549 这3株三阴性乳腺癌细胞中进行了pull-down，对circGFRA1进行富集，发现在circGFRA1富集产物中miR-34a也存在明显的富集情况[2]。随后一系列的实验结果证明，circGFRA1通过吸附miR-34a对其下游基因的表达进行调控，从而实现对肿瘤细胞增殖的促进作用。

circGFRA1富集产物中与miR-34a也存在明显的富集情况[2]

参考文献

1. Holdt, L.M., et al., Circular non-coding RNA ANRIL modulates ribosomal RNA maturation and atherosclerosis in humans. Nat Commun, 2016. 7; 12429.

2. He, R., et al., circGFRA1 and GFRA1 act as ceRNAs in triple negative breast cancer by regulating miR-34a. J Exp Clin Cancer Res, 2017.10;36(1): 145.

3. Jian X, He H, Zhu J, et al. Hsa_circ_001680 affects the proliferation and migration of CRC and mediates its chemoresistance by regulating BMI1 through miR-340. Mol Cancer. 2020 01;19(1):20.

通过pull-down实验将MS2-CP-MS2-circRNA复合物拉下来，WB检测MS2-CP蛋白，RT-qPCR检测目的circRNA的富集程度。

pull-down样品分组

WB检测结果

图5 pull-down 前后样本WB检测结果（Flag抗体）

1~8组分别对应pull-down实验分组样品编号

RT-qPCR验证pull-down富集效果

qPCR产物检测hsa_circ_00AAAAA富集倍数

图2 pull-down产物检测hsa_circ_00AAAAA富集倍数

1~8组分别对应pull-down实验分组样品编号