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circRNA pull-down实验
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常见问题

RNA pull-down是检测RNA结合蛋白与其靶RNA之间相互作用的主要实验手段之一。目前常用的两类技术,线性RNA替代法与探针钓取法,对同源性较高或表达丰度较低的circRNA并不适用。吉赛生物新一代circRNA pull-down技术,可对大部分circRNA实现高效率、强特异性的捕获。


89.png

RNA pull-down技术原理

实验流程

90.png

RNA pull-down实验流程

实验分组

91.png

RNA pull-down实验分组


技术优势

1. 实验体系捕获的是环形的circRNA分子,相对线性RNA替代法可信度更高;

2. 通过circRNA过表达载体引入外源标签,可降低来源基因的背景干扰;

3. RNA标签与捕获蛋白间的相互作用远远强于探针分子的捕获作用,特异性更高;

4. RNA标签的插入位置可灵活设计,能有效避免竞争性探针导致junction位置互作分子信息丢失问题;

5. 不依赖于细胞内本底表达的circRNA量,对细胞内表达丰度低的circRNA同样适用。


客户提供

1. circRNA名称(ID)、长度、序列、物种;

2. 指定载体名称

3. 实验目的;

4. 预测结合位点信息;

5. 细胞和细胞相关信息。


交付标准

1. 详细的circRNA pull-down完整实验报告(包含载体构建、诱导表达、pull-down富集等);

2. 带标签过表达质粒、不带标签过表达质粒、对照质粒(赠送)等。

3. 额外赠送以下情况任选一)

① 质谱检测2个样本;

② pulldown产物2个以内WB检测;

③ pulldown产物3个以内miRNA qPCR检测。


1、circRNA pull-down技术在circRNA与蛋白间相互作用研究中的应用

        在2016年Nature Communication杂志上发表了一篇关于circANRIL在动脉粥样硬化这一疾病中功能研究的文章中[1],作者使用了RNA标签BoxB对circANRIL进行了标记,在工具细胞293T中进行pull-down实验。

        作者对pull-down获得的蛋白进行质谱分析,结果显示,circANRIL结合蛋白中有38%与核糖体的形成有关,16%的蛋白参与了细胞内RNA的剪切调控[1] 。

        这一结果为作者的后续研究提供了重要的指示,预测circANRIL与核糖体RNA形成可能存在密切关系,同时也是一个强有力的证据。


circANRIL pull-down获得的蛋白质谱分析[1]


2、circRNA pull-down技术在circRNA与miRNA间相互作用研究中的应用

        2017年Journal of Experimental & Clinical Cancer Research杂志上发表的文章中,作者使用了MS2序列作为circRNA标签,在不同的乳腺癌肿瘤细胞中研究circRNA sponge功能。

        作者在circGFRA1中引入了MS2序列标签,分别在MDA-MB-231、MDA-MB-486和BT549 这3株三阴性乳腺癌细胞中进行了pull-down,对circGFRA1进行富集,发现在circGFRA1富集产物中miR-34a也存在明显的富集情况[2]。随后一系列的实验结果证明,circGFRA1通过吸附miR-34a对其下游基因的表达进行调控,从而实现对肿瘤细胞增殖的促进作用。


circGFRA1富集产物中与miR-34a也存在明显的富集情况[2]


参考文献

1. Holdt, L.M., et al., Circular non-coding RNA ANRIL modulates ribosomal RNA maturation and atherosclerosis in humans. Nat Commun, 2016. 7; 12429.

2. He, R., et al., circGFRA1 and GFRA1 act as ceRNAs in triple negative breast cancer by regulating miR-34a. J Exp Clin Cancer Res, 2017.10;36(1): 145.

3. Jian X, He H, Zhu J, et al. Hsa_circ_001680 affects the proliferation and migration of CRC and mediates its chemoresistance by regulating BMI1 through miR-340. Mol Cancer. 2020 01;19(1):20.




通过pull-down实验将MS2-CP-MS2-circRNA复合物拉下来,WB检测MS2-CP蛋白,RT-qPCR检测目的circRNA的富集程度。


pull-down样品分组

分组

pull-down抗体

Input 样品

样品编号

描述

pull-down组

anti-flag

CAAAAA-MS2+MS2-CP

5

目的circRNA富集产物

CAAAAA+MS2-CP

6

无捕获标签对照产物组

CAAAAA-MS2+NC

7

无捕获蛋白对照产物组

CAAAAA+NC

8

无捕获标签、蛋白对照产物组

IgG

CAAAAA-MS2+MS2-CP

IgG

阴性对照组


WB检测结果

图5 pull-down 前后样本WB检测结果(Flag抗体)

1~8组分别对应pull-down实验分组样品编号


RT-qPCR验证pull-down富集效果

qPCR产物检测hsa_circ_00AAAAA富集倍数

Sample name

hsa_circ_00AAAAA

Average CT

(Input)

hsa_circ_00AAAAA

Average CT

(pull-down)

2-ΔΔCT1

2-ΔΔCT2

2-ΔΔCT3

Average   2-ΔΔCT±SD

SEM

6

21.7±0

24.5±0

1

1

1

1±0

0

7

21.4±0

23.89±0

1.24

1.24

1.24

1.24±0

0

8

22.19±0

24.85±0

1.1

1.1

1.1

1.1±0

0

IgG

23.3±0

25.19±0

1.88

1.88

1.88

1.88±0

0

5

23.3±0

18.62±0

178.53

178.53

178.53

178.53±0

0

图2 pull-down产物检测hsa_circ_00AAAAA富集倍数

1~8组分别对应pull-down实验分组样品编号
















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