circRNA qPCR引物设计circRNA qPCR检测全转录组测序 | RNA-seqcircRNA测序 | circRNA-seq外泌体RNA测序 | Exosome RNA-seq生物医学大数据挖掘circRNA qPCR引物设计合成(1)circRNA表达分析circRNA过表达实验circRNA干扰实验细胞功能实验慢病毒包装circRNA功能分析RNA m6A甲基化测序 | MeRIP-SeqcircRNA表观转录组T系列-circRNA翻译验证R系列-IRES活性检测核糖体印迹测序 | Ribo-seq核糖体-新生肽链复合物测序 | RNC-seqcircRNA翻译-验证研究circRNA注释及功能预测circRNA荧光素酶报告检测circRNA RIP实验circRNA pull-down实验circRNA FISH探针合成circRNA相互作用组学研究circRNA FISH探针合成circRNA定位分析circRNA全长纳米孔测序 | ONT circRNA full-length Sequencin三代测序全转录组测序 | RNA-seqcircRNA测序 | circRNA-seqmRNA测序 | mRNA-seq小RNA测序 | miRNA-seq转录组学研究核糖体印迹测序 | Ribo-seq核糖体-新生肽链复合物测序 | RNC-seq翻译组学研究RNA m6A甲基化测序 | MeRIP-Seq染色质开放性测序 | ATAC-seq表观组学研究10×Visium空间转录组测序空间转录组学研究外泌体RNA测序 | Exosome RNA-seq外泌体提取及鉴定外泌体研究RNA免疫共沉淀测序 | RIP-seq染色质免疫共沉淀测序 | ChIP-seq核酸蛋白互作研究微生物宏基因组测序 | Metagenomics Sequencing基因组学研究生物医学大数据挖掘分析circRNA定制化分析及绘图常规组学及多组学联合分析单细胞测序数据生信分析生物信息学分析服务(右边模板)科研服务RNase RcircRNA qRT-PCR试剂盒circRNA检测circRNA过表达系列circRNA过表达载体系列血液基因组DNA提取试剂盒全血RNA提取试剂盒细胞RNA提取试剂盒核酸提取与纯化RNA pull-down试剂盒RIP试剂盒T7转录试剂盒(生物素标记)分子互作系列外泌体提取试剂盒Taqman探针法支原体检测试剂盒(UNG防污染版)支原体检测核糖体RNA去除试剂盒(人/大鼠/小鼠)核糖体RNA去除试剂盒(植物)RNA-seq文库构建试剂盒RNA建库接头试剂DNA磁珠RNA磁珠高通量测序系列circRNA标准品系列CircLucT7耐高温高产量RNA合成试剂盒环状RNA合成试剂盒T4 RNA连接酶1T4 RNA连接酶2circRNA制备系列(右边模板)产品中心
circRNA全长纳米孔测序 | ONT circRNA full-length Sequencin
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常见问题

利用随机引物对富集后的circRNA进行滚环反转录扩增,采用纳米孔测序技术对circRNA的全长序列进行直接测序,并使用特定算法,实现对长测序片段中的circRNA序列进行识别和全长重构。


1circRNA全长纳米孔测序技术路线


测序方案

测序模式:Nanopore sequencing

测序数据量:1 Gb raw data


纳米孔测序技术在检测circRNA上的优势:

1. 更强的检出率circRNA reads检测效率提高20倍以上

2. 更高的灵敏度可识别低丰度的circRNA,能够更敏感地捕获到非经典circRNA

3. 更准确的表达定量:消除了传统reads count的偏差;

4. 准确识别可变剪切事件完整捕获RNA分子,无须拼接,识别隐藏复杂结构


基于三代测序技术分析circRNA全长

Comprehensive profiling of circular RNAs with nanopore sequencing and CIRI-long. Zhang J et al. Nature biotechnology, 2021. (IF: 36.558)


测序策略:circRNA Nanopore sequencing

研究样本:小鼠脑组织


        本研究开发了一种高效测定circRNA全长转录本的实验和计算方法:利用随机引物对circRNA进行的滚环反转录扩增后,使用纳米孔测序技术对circRNA的全长序列进行直接测序,并开发了CIRI-long 算法,实现对长测序读段中的circRNA序列进行准确识别和全长重构。

        作者发现优化后的纳米孔测序体系能够在总Reads中测到6%的circRNA信息,而在传统的PE150二代测序数据中,总RNA测序结果中只有0.06%的Reads是circRNA数据,RNase R处理也只能得到0.27% 的circRNA数据。相对于二代测序,纳米孔三代测序结合CIRI-long分析方法可以将检测效率提高20多倍。并且,纳米孔三代测序能够实现<100bp~5kb长度circRNA的全序列组装,而二代测序(PE150)仅能拼接300bp以内的序列。比较对照的二代测序数据以及CircAtlas数据库信息,本文的体系得到了更多circRNA信息。纳米孔测序得到了一半多的全新circRNA,但这些circRNA的丰度较低,说明纳米孔测序体系具有更高的灵敏度,可以检测到更多的circRNA分子(图1)。两次生物学重复的样品能很好地吻合,说明该体系具有较高的稳定性(图2)。

Figure.纳米孔测序体系具有更强的检出率


Figure.纳米孔测序体系具有较高的稳定性


        circRNA可变剪切是多样性的重要体现,作者从这批纳米孔测序数据中分析了circRNA可变剪切的情况,在15905个基因来源的circRNA中共分析到115755种可变剪切分子。而二代测序的数据中只从6928个基因中分析到了25159种可变剪切分子。四种类型的可变剪切都存在,总体而言,在纳米孔测序的数据中分析得到的可变剪切数目均高于二代测序的数据(图3)。作者还发现了内含子自动形成的circRNA(图4)。

Figure. CIRI-long分析circRNA和剪切多样性


Figure.内含子自剪切形成的circRNA





生物信息分析

基础分析

原始数据质控检查

比对结果质控检查

样品表达质控

基于circRNA表达的样品主成分分析

circRNA全长鉴定

circRNA在染色体上的分布特征分析

circRNA长度统计与分析

circRNA可变剪切isoform识别


高级分析

circRNA差异分析

差异circRNA宿主基因的GO功能分析

差异circRNA宿主基因的KEGG通路富集分析

差异circRNA宿主基因的Reactome通路富集分析

差异circRNA的靶向miRNA预测分析

circRNA及靶向miRNA网络调控图

circRNA-RBP 关系预测

circRNA 翻译潜能预测


个性化分析

融合基因来源的f-circRNA识别融合基因来源的f-circRNA


部分结果展示

1circRNA全长纳米孔测序鉴定的circRNA可变剪切图谱


图2. 癌症与癌旁差异表达circRNA


3. 癌症/癌旁差异表达circRNA功能富集通路



Table.ONT circRNA full-length Seq原始样本送样建议

送样类型

送样量

备注

细胞 (细胞数)

≥2*10^6

无支原体污染

动物组织

≥200mg


植物组织

≥200mg


全血

≥4mL



Table.ONT circRNA full-length Seq RNA样本送样建议

送样类型

送样量

完整性(RIN值)

浓度

纯度

total RNA(组织、细胞、全血等)

≥4μg

≥7

≥100ng/μl

无DNA,蛋白/盐离子等污染,样本无色透明不粘稠

*更具体的送样方法请详询销售或技术支持

物种范围:人、小鼠、大鼠等哺乳动物,拟南芥、水稻、番茄、玉米、大豆等植物,其他物种详询销售或技术支持








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