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circRNA测序 | circRNA-seq
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常见问题

利用circRNARNase R的耐受性从而富集circRNA,去rRNA后进行链特异建库,采用Illumina平台对circRNA文库进行测序,通过生信分析得到circRNA的表达结果。



circRNA测序技术路线


测序方案

测序平台Illumina Novaseq 6000

测序模式PE150

测序数据量10 Gb


人喉鳞状细胞癌中circRNA的RNA-seq表达谱

RNA-Seq profiling of circular RNAs in human laryngeal squamous cell carcinomas

Lu et al. Molecular Cancer (2018) 17:86(IF:6.204)

测序策略:circRNA测序(RNase R+)

样本分组:10例,5例肿瘤组织(2例高分化,3例中分化),5例正常组织


人喉鳞状细胞癌(LSCC)是起源于喉黏膜上皮组织的恶性肿瘤,是头颈部肿瘤中恶性程度非常强的肿瘤,世界范围内每年发生率占比2.4%,近年内还有逐渐增加趋势。本研究主要关注circRNA在LSCC疾病中的表达情况。研究者选择10例LSCC患者临床组织标本(2例高分化、3例为中分化、 5例正常)进行RNA高通量测序,分析样本中circRNA表达情况。共鉴定出21444个circRNA,其中在LSCC样本中显著上调的circRNA 29个,显著下调circRNA 19个,进一步结合临床特征(高分化,中分化和正常)进行分类,将差异表达circRNA缩小到18个和5个(图1)。CircRNA-miRNA-mRNA调控网络预测分析,发现20个失调控circRNA与多种肿瘤相关的miRNA相关,信号通路KEGG富集分析发现,过氧化物酶体PPAR、轴突导向、Wnt和细胞周期通路与LSCC密切相关(图2)。随后的qPCR验证结果显示(图3),has_circ:chr20:31876585-31,897,648可以很好区分LSCC标本和正常标本,表明circRNA可作为LSCC潜在的理想标志物。




1 LSCC样本中circRNA差异表达谱


2 CircRNA及靶向miRNA网络调控图与KEGG代谢通路富集分析

3 hsa_circ:chr20:31876585–31,897,64810LSCC肿瘤样本及正常样本中的Q-PCR验证



生物信息分析

基础分析

原始数据质控检查

比对结果质控检查

基因覆盖度分析

circRNA预测及鉴定

circRNA序列预测

基于circRNA表达的样品主成分分析


高级分析

circRNA差异分析

差异circRNA宿主基因的GO功能分析

差异circRNA宿主基因的KEGG通路分析

差异circRNA宿主基因的Rectome通路分析

差异circRNA的靶向miRNA预测分析

差异circRNA及靶向miRNA网络调控制图


部分结果展示

图1:根据不同的基因组位点外显子、内含子、反义、基因内和基因间对表达差异显著的circRNA进行分类


2:绘制火山图Circos图揭示每个circRNA在人类染色体上的位置


3热图火山图分析circRNA的表达差异倍数



Table.circRNA-seq原始样本送样建议

送样类型

送样量

备注

细胞 (细胞数)

≥1*10^6

无支原体污染

动物组织

≥100mg


植物组织

≥100mg


全血

≥4mL


FFPE

8-10片,未染色,厚度10μm



Table.circRNA-seq RNA样本送样建议

送样类型

送样量

完整性(RIN值)

浓度

其他

纯度

total RNA(组织、细胞、全血等)

≥4ug

≥7

≥100ng/μl


无DNA,蛋白/盐离子等污染,样本无色透明不粘稠

FFPE组织RNA

≥4ug

≥3

/

DV200>30%

*更具体的送样方法请咨询销售或技术支持

物种范围:人、小鼠、大鼠等哺乳动物,拟南芥、水稻、番茄、玉米、大豆等植物,其他物种详询销售或技术支持


Q1:circRNA测序与全转录组测序有什么不同?

A1全转录组测序采用去rRNA链特异性的建库方式,数据分析内容包含了mRNAlncRNAcircRNA全部信息,数据质量较好。CircRNA测序采用去rRNA去线性链特异性的建库方式,通过RNase R 消化线性RNA从而富集circRNA,对建库起始量要求较高(一般大于2μg),测序数据质量较全转录组稍差,但可将circular junction reads数提高10倍以上,更适合专注circRNA研究的项目。


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