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mRNA测序 | mRNA-seq
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常见问题

通过oligo-dT磁珠捕获带polyA尾的RNA进行建库测序,可研究mRNA差异表达或检测结构变异,筛选与疾病或性状相关的分子标记还可揭示转录组的复杂性,确定基因以及转录本结构、可变剪接、RNA编辑、带polyA尾的非编码RNA和新转录本。



mRNA测序技术路线


测序方案

上机平台Illumina Novaseq 6000   

测序模式PE150

测序数据量5 Gb raw data


生物信息分析

原始数据质控检查

比对结果质控检查

基因覆盖度分析

基于基因表达的样品主成分分析

基因表达分析

差异基因表达分析

差异基因GO功能分析

差异基因KEGG通路分析

差异基因Rectome通路分析

针对mRNA基因GSEA分析


可选分析

可变剪切分析(测序数据量为12Gb


部分结果展示

图1.差异表达基因热图展示


图2.差异表达基因KEGG通路富集图展示


图3. mRNA的GSEA分析毛毯图展示


图4. 单个可变剪切事件sashimi plot


5. 可变剪切事件数目统计展示

Table1. mRNA-seq原始样本送样建议

送样类型

送样量

备注

细胞 (细胞数)

≥1*10^6

无支原体污染

动物组织

≥100mg


植物组织

≥100mg


全血

≥4mL


Table2. mRNA-seq RNA样本送样建议

送样类型

送样量

完整性(RIN值)

浓度

纯度

total RNA(组织、细胞、全血等)

≥2μg

≥8

≥100ng/μl

无DNA,蛋白/盐离子等污染,样本无色透明不粘稠

*更具体的送样方法请咨询销售或技术支持

物种范围:人、小鼠、大鼠,拟南芥、水稻、番茄、玉米、大豆等真核生物,其他物种详询销售或技术支持


Q1:所有真核生物都能做mRNA测序吗?

A1:真核生物mRNA含有poly-A尾,我们目前常用于富集真核生物mRNA的方法就是采用附着poly-T oligo的磁珠从total RNA 中抓取mRNA,进行建库测序。所以理论上说,所有的真核生物都能进行mRNA测序。

如果是非常规物种,建议客户提供物种的拉丁名,进行评估,如物种参考基因组的注释信息足够开展分析,是可以做的。


Q2:为什么mRNA测序对RNA的完整性要求比全转录组测序的高?

A2:mRNA测序建库是用磁珠捕获带polyA尾的RNA(大部分是mRNA)进行建库的,如果RNA的完整性较差,部分mRNA降解,polyA尾断开,能捕获到的mRNA相对完整性好的样本要少,基因的覆盖度相对就较差。因此对RNA的完整性要求更高。


Q3:mRNA-seq 是否可以检测非编码 RNA?

A3:mRNA-seq 主要捕获带有 poly(A) 尾巴的 RNA 分子,因此,所有带有 poly(A) 尾巴的分子理论上只要在细胞中表达都有可能被检测到,主要包括:1)mRNA;2)带 poly(A) 尾的 lncRNA。


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