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RNA m6A甲基化测序 | MeRIP-Seq
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常见问题

通过m6A特异性抗体识别并结合具有m6A修饰的RNA片段进行免疫共沉淀,对富集下来的RNA片段进行高通量测序。结合生物信息学分析,即可在全转录组范围内对m6A修饰进行系统研究。

33 meRIP测序.png

RNA m6A甲基化测序技术路线

测序方案

上机平台Illumina Novaseq 6000   

测序模式PE150
测序数据量12 Gb raw data


案例1


案例2







生物信息分析

基础分析

测序数据质量评估

比对结果质控

基因覆盖度分析

m6A peaks识别

m6A peaks特征注释

m6A mRNA分析

甲基化mRNAmotif分析

m6A lncRNA分析

甲基化lncRNAmotif分析

circRNA识别鉴定分析

circRNAm6A富集分析

甲基化circRNAmotif分析


高级分析

甲基化基因的差异表达分析

差异甲基化基因GO功能富集分析

差异甲基化基因KEGG通路分析

差异甲基化基因reactome通路分析

甲基化lncRNA的差异表达分析

差异甲基化lncRNA的顺式编码基因的GO功能富集分析

差异甲基化lncRNA的顺式编码基因的KEGG通路分析

差异甲基化lncRNA的顺式编码基因的Reactome通路分析

甲基化circRNA的差异表达分析

差异甲基化circRNA宿主基因的GO功能富集分析

差异甲基化circRNA宿主基因的KEGG通路分析

差异甲基化circRNA宿主基因的Reactome通路分析


个性化分析

与转录组关联分析

关联分析四象限图

部分结果示例


图片1.png

图1. RIP 富集分布分析


图2. m6A基因组特征分布分析


3. m6A 全基因组分布分析



4. m6A的元基因分析


5. m6A 特定基因丰度展示


6. KEGG通路富集分析


7. Motif分析


8. 转录组联合分析四象限图



Table.MeRIP-Seq原始样本送样建议

送样类型

送样量

备注

细胞 (细胞数)

≥5*10^7

无支原体污染

动物组织

≥300mg


植物组织

≥300mg


Table.MeRIP-Seq RNA样本送样建议

送样类型

送样量

完整性(RIN值)

浓度

纯度

total RNA

≥200μg

≥7

≥100ng/μl

无DNA,蛋白/盐离子等污染,样本无色透明不粘稠


*更具体的送样方法请详询销售或技术支持

物种范围:人、小鼠、大鼠等哺乳动物,其他物种请咨询销售或技术支持


Q1:做MeRIP-seq是否还需要另外做普通的转录组测序?

A1:不需要,Input数据即可作为普通全转录组测序数据进行分析。


Q2:为什么MeRIP-seq需要同时测Input和IP样本?

A2:MeRIP-seq实验设置中Input和IP组成一对样品。实验环节IP样品用m6A抗体特异性富集甲基化修饰的RNA片段,而Input仅仅是片段化的RNA则作为对照消减背景噪音,在建库、测序平行开展。结合峰检测分析需整合两个样本的数据,并利用Input数据排除本底表达水平高或非特异性结合的peaks,以提高calling peak的准确性。


Q3:开展MeRIP-seq是否有物种限制?

A3:如不是人、小鼠和大鼠的物种建议先进行咨询。一般有参考基因组,且基因组拼接至染色体水平,gtf注释文件较完整的物种都可以开展;真核、原核或病毒在结合峰检测涉及的软件和参数存在差别,原核或病毒项目建议先评估。


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