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RNase R
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3 RNase R 500U.jpg


RNase R是一种来源于大肠杆菌RNR超家族的3’-5’核糖核酸外切酶,可从3’-5’方向将RNA逐步切割成二核苷酸和三核苷酸。RNase R可消化几乎所有的线性RNA分子,但不易消化环形RNA、套索结构或3’突出末端少于7个核苷酸的双链RNA分子。

RNase RcircRNA的鉴定和富集实验必备工具酶,可消化线性RNA以使环形RNAcircRNAs或套索结构RNAlariat RNA得到富集。



图1.RNase R消化RNA示意图


应用场景

1. circRNA的鉴定

根据RNase R(+)RNase R(-)组中是否检测到条带来证明检测的分子是否是circRNA


图片2.png


2.RNase R消化后RT-PCR检测Lariat/Circular RNA


在图2中,检测mRNA在RNase R(-)中有条带,在RNase R(+)中无条带;检测Lariat/Circular RNA,在RNase R(-)RNase R(+)样品中都有条带,表明mRNA被消化,而Lariat/Circular RNA耐受消化(Suzuki H et al., 2006


2. circRNA的富集

高通量测序时常需要对circRNA进行富集,为探究RNase R消化后circRNA的富集程度和相关基因的变化,可以同时做RNase R(+)RNase R(-)组样品的测序。

图片3.png


3.RNase R(+)RNase R(-) RNA测序示意图(Jeck WR et al., 2014


有研究报道,测序显示RNase R(+)组中Junction Reads相对于RNase R(-)样本有5-10倍的富集,可鉴定出几千到上万个circRNAs3


3. circRNA纯化

消除线性RNA残余的干扰,是人工合成高纯度circRNA的关键。高效的RNase R不仅是连接酶法circRNA人工合成的关键工具,在内含子自剪切circRNA人工合成中也是必不可少的。


产品信息

名称
货号
规格
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GSPure®RNase R
R0301500 U2280-20℃
R0302
5000 U

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产品优势

特异性特异性消化线性RNA

高效快速:5-15min即可消化大部分线性RNA

Buffer兼容:消化产物可直接用于下游实验

使用方便:体系简单,37℃步反应


质量控制

SDS-PAGE 检测纯度>99%Total RNARNase R消化后进行RT-qPCR检测,线性 RNA丰度明显降低,环形RNA丰度基本不变。


性能比较

1. RNA电泳检测

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将10U RNase R加入到2.5 μg Total RNA中,于37℃孵育15 min后直接进行电泳检测,结果显示RNase R(+)组条带变淡(不可见),表明RNase RTotal RNA产生消化作用。吉赛和公司A或公司ERNase RTotal RNA消化效果相当。


2. RT-qPCR检测

微信图片_20221104174007.jpg

将10U RNase R加入到2.5 μg total RNA中,于37℃孵育30 min后进行RT-qPCR实验,结果显示RNase R+β-actinFGFR2的丰度都明显降低,表明RNase R可消化线性RNA。吉赛和公司ERNase R对线性RNA消化效果相当,优于公司ARNase R


微信图片_20221104174007.jpg

将10U RNase R加入到2.5 μg total RNA中,于37℃孵育30 min后进行RT-qPCR实验,结果显示RNase R+ 组中hsa_circFOXO3_002hsa_circMTO1_001的丰度基本不变,表明circRNA耐受RNase R的消化。吉赛和公司E或公司ARNase R效果相当。


注:数据计算以“RNase R+吉赛组为对照,设定其相对丰度值为1

案例1:

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2022年7月21日,西北大学生命科学学院关锋教授团队在C1GALT1在膀胱癌中的生物功能及其调控机制的研究中取得了新进展,研究结果发表在Journal of Experimental & Clinical Cancer Research,题名“Dysregulation and prometastatic function of glycosyltransferase C1GALT1 modulated by cHP1BP3/ miR-1-3p axis in bladder cancer”。


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研究团结队使用RNase R(R0301,吉赛生物)检测了7个DEcircRs对RNase R消化的敏感性,以排除可能通过反式剪接、基因组重排或PCR产物产生的头尾剪接。证明DEcircRs对RNase R的抗性均高于GAPDH对照。


案例2:

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2022年8月12日,北京大学基础医学院张卫光教授团队Redox Biology杂志在线发表了题为“CircSV2b participates in oxidative stress regulation through miR-5107-5p-Foxk1-Akt1 axis in Parkinson's disease”的研究论文。该研究发现circRNA分子 circSV2b在帕金森病(Parkinson's disease,PD)发病过程中发挥着重要作用,并揭示了其作用机制。


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研究团结队使用RNase R(R0301,吉赛生物)处理显著降低线性SV2b和β-Actin的mRNA水平,而circSV2b的量未观察到明显的改变,证明circSV2b是一个高度稳定且内含子保留的环状RNA。

[1] IF27.401 A novel protein AXIN1-295aa encoded by circAXIN1 activates the Wnt/β-catenin signaling pathway to promote gastric cancer progression. Molecular Cancer


[2] IF15.302 circPARD3 drives malignant progression and chemoresistance of laryngeal squamous cell carcinoma by inhibiting autophagy through the PRKCI-Akt-mTOR pathway. Molecular Cancer


[3] IF15.302 Circular RNA circCORO1C promotes laryngeal squamous cell carcinoma progression by modulating the let-7c-5p/PBX3 axis. Molecular Cancer


[4] IF13.493 The circFASN/miR-33a pathway participates in tacrolimus-induced dysregulation of hepatic triglyceride homeostasis. Signal Transduction and Targeted Therapy


[5] IF12.658 Dysregulation and prometastatic function of glycosyltransferase C1GALT1 modulated by cHP1BP3/ miR-1-3p axis in bladder cancer. JOURNAL OF EXPERIMENTAL & CLINICAL CANCER RESEARCH


[6] IF11.556 Engineering circular RNA regulators to specifically promote circular RNA production. Theranostics


[7] IF11.492 CircIMMP2L promotes esophageal squamous cell carcinoma malignant progression via CtBP1 nuclear retention dependent epigenetic modification. Clinical and Translational Medicine


[8] IF11.161 Circular RNA circ-MTHFD1L induces HR repair to promote gemcitabine resistance via the miR-615-3p/RPN6 axis in pancreatic ductal adenocarcinoma. JOURNAL OF EXPERIMENTAL & CLINICAL CANCER RESEARCH


[9] IF11.161 Warburg effect-promoted exosomal circ_0072083 releasing up-regulates NANGO expression through multiple pathways and enhances temozolomide resistance in glioma. JOURNAL OF EXPERIMENTAL & CLINICAL CANCER RESEARCH


[10] IF11.161 CircFAM73A promotes the cancer stem cell-like properties of gastric cancer through the miR-490-3p/HMGA2 positive feedback loop and HNRNPK-mediated β-catenin stabilization. JOURNAL OF EXPERIMENTAL & CLINICAL CANCER RESEARCH


[11] IF11.161 CircAGAP1 promotes tumor progression by sponging miR-15-5p in clear cell renal cell carcinoma. JOURNAL OF EXPERIMENTAL & CLINICAL CANCER RESEARCH


[12] IF10.392 A novel intronic circular RNA, circGNG7, inhibits head and neck squamous cell carcinoma progression by blocking the phosphorylation of heat shock protein 27 at Ser78 and Ser82. Cancer Communications


[13] IF10.122 Lipotoxicity-induced circGlis3 impairs beta cell function and is transmitted by exosomes to promote islet endothelial cell dysfunction. DIABETOLOGIA


[14] IF8.886 circRNA-0002109 promotes glioma malignant progression via modulating the miR-129-5P/EMP2 axis. Molecular Therapy-Nucleic Acids


[15] IF8.886 HnRNP-L-regulated circCSPP1/miR-520h/EGR1 axis modulates autophagy and promotes progression in prostate cancer. Molecular Therapy-Nucleic Acids


[16] IF8.886 Effects of long-term culture on the biological characteristics and RNA profiles of human bone-marrow-derived mesenchymal stem cells. Molecular Therapy-Nucleic Acids


[17] IF8.886 CircSTK40 contributes to recurrent implantation failure via modulating the HSP90/AKT/FOXO1 axis. Molecular Therapy-Nucleic Acids


[18] IF8.579 circPTCH1 promotes invasion and metastasis in renal cell carcinoma via regulating miR-485-5p/MMP14 axis. Theranostics


[19] IF8.469 Circular RNA hsa_circ_0043280 inhibits cervical cancer tumor growth and metastasis via miR-203a-3p/PAQR3 axis. Cell Death & Disease


[20] IF8.469 CircHAS2 promotes the proliferation, migration, and invasion of gastric cancer cells by regulating PPM1E mediated by hsa-miR-944. Cell Death & Disease


[21] IF8.469 Autophagy-related circRNA evaluation reveals hsa_circ_0001747 as a potential favorable prognostic factor for biochemical recurrence in patients with prostate cancer. Cell Death & Disease


[22] IF8.469 Circular RNA circACSL1 aggravated myocardial inflammation and myocardial injury by sponging miR-8055 and regulating MAPK14 expression. Cell Death & Disease


[23] IF8.469 Circular RNA circRUNX1 promotes papillary thyroid cancer progression and metastasis by sponging MiR-296-3p and regulating DDHD2 expression. Cell Death & Disease


吉赛生物GSPure®RNase R Cat.No.R0302.pdf
314.2KB下载
吉赛生物GSPure®RNase R Cat.No.R0301.pdf
324.4KB下载
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1.RNase R消化成功的标准?

建议RNA经RNase R消化后取一部分直接进行电泳检测,28、18S条带变淡说明消化成功。电泳结果比较直接,可观测到消化成功,若不成功就是有问题


2.RNase R实验怎样设计对照组?

参考下图多几个分组和对照,排除下影响因素。增加多个对照,可以排除和找出异常情况的原因


3.RNase R实验的条件?

消化时间和RNase R用量可能需要预实验摸索,找到合适的条件,让线性RNA被消化而 circRNA保持不变。一般37℃消化15min,检测内参的Ct值延后5~10都是比较成功的结果。考虑消化不够或过头,或者结果数值不好看,可以做预实验摸索


4.RNase R引物检测的问题?

注意检测引物的特异性问题。注意区分circRNA和mRNA的同源序列。(引物有非特异扩增的时候,检测结果数值完全不可能,任何说消化无效果或效果过头都不可信


5.CircRNA数量不变,算成功吗?

总RNA被消化后,线性RNA数量减少,circRNA数量基本不变,则其中circRNA的比例增加了,即circRNA被富集了,后面qPCR检测circRNA的丰度有可能会偏高,是正常的。


6. RNase R消化后如何回收RNA?

RNase R消化后消化液如果回收,图方便可以使用Trizol回收,按说明书操作即可。如果不回收直接进行逆转录的,吸取消化液的体积不能超过逆转录体系的1/4,因为消化液中残留的离子等会干扰下游的RT-qPCR反应。例如逆转录是20ul体系,则吸取的RNase R消化液不能超过5ul


7.RNase R消化不成功怎么办?

使用新的试剂盒或试剂重新提取RNA,保证RNA的纯度和质量。RNA的纯度高才能消化效率高,酚类等残留会明显影响消化效果,gDNA污染也会减弱消化效果


8. RNase R如何储存

当天内使用的,RNase R(20U/ul可以用无酶水稀释,长期使用的,应该用Storage Buffer稀释,配方在说明书里有。(用量少时体积小,有客户想稀释使用)


9.RNase R消化有什么注意事项

配置Nuclease-free的试剂,需要使用Nuclease-free的水、吸头等试剂耗材,或者用DEPC处理过的水,另外实验台面(建议全程超净台内或生物安全柜内)也要用核酸酶清除剂喷雾和擦拭处理,这些都是做RNA实验的配置。


10.RNase R消化的特殊情况

特殊情况:有的线性RNA耐受消化,有的circRNA也容易被消化。


11.RNase R消化后不用纯化,直接跑胶,是否可以?

可以的。还能评估下消化效果,28、18S条带变淡说明消化成功。

另,直接进行RT-PCR的,一般也可以不做纯化,酶失活后直接进行逆转录反应即可。


12.消化反应中RNase R使用多少比较合适?

不同参考文章里RNase R的使用量和反应体系都有差别,最常见的是20 μL反应体系,使用比例为1-4 U RNase R/μg RNA,实验中可能需要摸索调整。


13.RNase R消化反应温度和时间设定多少?

RNase R消化一般于37℃进行反应,一般10-30 min即可消化掉大部分线性 RNA。常用5-15 min消化就能得到很好的结果。


14.RNase R消化反应后要不要灭活?

经RNase R消化后直接进行逆转录反应的,推荐在37℃反应结束后保持70℃ 10 min使RNase R灭活(也有65℃ 15min)。如果消化后要进行纯化回收,也可以不做灭活。


15.RNase R消化鉴定

样本RNase R消化前后取一部分直接进行电泳检测,可直观查看抽提的RNA质量及Rnase R消化效果,28、18S条带变淡说明消化成功。若RNA纯度不高,28S/18S条带可能有凹型拖尾。若RNA有gDNA污染,可能残留gDNA条带。


16.RNase R消化反应条件?

不同的circRNA对RNase R的耐受性不同,具体反应时间需要自行摸索。一般反应时间为10-30 min,不推荐过长时间的消化。个别circRNA耐受RNase R消化力弱。对此,可以减少消化时间。


17.RNase R消化后需要测定产物浓度吗?

不可直接测定RNA浓度,因为反应体系内的蛋白质、盐离子等成分会导致RNA浓度测定不准确。建议先纯化RNA再测定浓度。


18.RNase R消化后产物处理:

直接进行逆转录反应的,推荐RNase R灭活。灭活条件为:70℃保持15min。吸取消化液的体积不能超过逆转录体系的1/4,因为消化液中残留的离子等会干扰下游的RT-qPCR反应。例如逆转录是20ul体系,则吸取的RNase R消化液不能超过5ul。

如果消化后要进行纯化回收,也可以不做酶的失活。




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