RIP实验的目的是分析与目的蛋白结合的RNA，原理则是运用针对目的蛋白的抗体把相应的RNA-蛋白复合物沉淀下来，经过分离纯化并对结合在复合物上的RNA进行测序或PCR分析。

2016年9月23日，意大利Maria R. Matarazzo教授在Methods in Molecular Biology杂志介绍了RIP实验的经典操作方法。文中介绍的RIP实验操作流程如下图所示：

图1 经典RIP实验操作流程（来自[1]）

而RIP实验有哪些应用呢？大家都知道RNA是一种不稳定的生物大分子，绝大多数RNA都需要与特定的RNA结合蛋白形成RNA-蛋白复合物才能稳定存在于细胞中。RNA-蛋白复合物驱动了几乎所有细胞过程的基因表达的转录后调控，包括剪接（splicing）、出核转运（nuclear export）、mRNA稳定性以及蛋白转译过程。因此，对基因调控的了解就有赖于确定这些过程中RNA的结合的变化，RIP技术应运而生，可应用于研究miRNA调节靶点、RNA与RNP（RNA结合蛋白）的互作关系等。

案例1

RIP用于研究circRNA与蛋白互作

2022年3月29号，重庆医科大学的陈俊霞教授在Mol Cancer发表文章Hypoxia-induced circWSB1 promotes breast cancer progression through destabilizing p53 by interacting with USP10，本研究揭示了一种新的机制，即缺氧诱导的circWSB1可以与USP10相互作用，从而减弱USP10介导的p53稳定并促进BC的进展，为BC提供了一种替代的预后生物标记物和治疗靶点。

图2

已有报道发现，环状RNA通过miRNA海绵机制参与缺氧的调控。几乎所有这些与缺氧相关的circRNA都起到了miRNA海绵的作用，环状RNA同样可以通过结合蛋白以及翻译多肽发挥功能。作者使用pull-down对环状RNA的结合产物进行分析，虽然没有发现P53，但是作者发现泛素化酶USP10与circWBS1相互结合。使用数据库对二者的结合位点进行了预测。设计USP10的全长和缺失突变体并插入Flag标签（图3），通过RIP实验（使用吉赛生物RIP试剂盒）对USP10与circWBS1的结合进行了验证。

图3

案例2

RIP用于研究lncRNA与蛋白互作

图4 lncRNA和编码RNA与EZH2结合能力的比较（来自[3]）

在本研究中，使用EZH2特异性抗体对人胃癌细胞系MKN45和AGS，以及对照细胞系GES-1进行RIP-seq，分析了8256个与EZH2相关的RNAs，包括编码和非编码RNAs，其中MALAT1在MKN45细胞系中高表达。并且发现MALAT1通过和EZH2相互作用，抑制原钙黏蛋白因子10（PCDH10）的表达，从而促进胃癌细胞的侵袭和转移[3]。

案例3

RIP用于研究miRNA与蛋白互作

图5 缺铁性和非缺血性NPCs中isomiRs分析（来自[4]）

在本研究中，利用Ago2 RIP-seq，分析非缺血性和缺血性成年大鼠侧脑室下区（SVZ）的神经祖细胞（NPCs）miRNAs的表达情况[4]。

结果显示，相较于非缺血性NPCs，中风改变了NPCs中Ago2相关的miRNAs表达，缺血性NPCs中的isomiRsreads数增加，其中5'末端添加核苷酸的isomiR-142-5p_L+2R-1显著上调，5'末端缺失核苷酸的isomiR-187-5p_L-2R+3显著下调[4]。

案例解析参考文献

1.RIP: RNA Immunoprecipitation.Methods Mol Biol, 2016. 1480: p. 73-86.

2.Hypoxia-induced circWSB1 promotes breast cancer progression through destabilizing p53 by interacting with USP10[J]. Molecular Cancer, 2022, 21(1):1-20.

3.MALAT1 long ncRNA promotes gastric cancer metastasis by suppressing PCDH10.Oncotarget. 2016 Mar 15; 7(11): 12693–12703.

4.Identification of miRNomes associated with adult neurogenesis after stroke using Argonaute 2-based RNA sequencing.RNA Biol. 2017; 14(5): 488–499.

[1] IF27.401 The circACTN4 interacts with FUBP1 to promote tumorigenesis and progression of breast cancer by regulating the expression of proto-oncogene MYC. Molecular Cancer

[2] IF17.388 N6-methyladenosine reader IMP2 stabilizes the ZFAS1/OLA1 axis and activates the Warburg effect: implication in colorectal cancer. Journal of Hematology & Oncology

[3] IF14.919 The genomic landscape of cholangiocarcinoma reveals the disruption of post-transcriptional modifiers. Nature Communications

[4] IF11.161 A novel lncRNA ARST represses glioma progression by inhibiting ALDOA-mediated actin cytoskeleton integrity. JOURNAL OF EXPERIMENTAL & CLINICAL CANCER RESEARCH

[5] IF9.261 Mettl14 mediates the inflammatory response of macrophages in atherosclerosis through the NF-κB/IL-6 signaling pathway. CELLULAR AND MOLECULAR LIFE SCIENCES

[6] IF8.886 ac4C acetylation of RUNX2 catalyzed by NAT10 spurs osteogenesis of BMSCs and prevents ovariectomy-induced bone loss. Molecular Therapy-Nucleic Acids

[7] IF8.718 The m6A reader IGF2BP3 promotes acute myeloid leukemia progression by enhancing RCC2 stability. EXPERIMENTAL AND MOLECULAR MEDICINE

[8] IF8.679 IGF2BP2-dependent activation of ERBB2 signaling contributes to acquired resistance to tyrosine kinase inhibitor in differentiation therapy of radioiodine-refractory papillary thyroid cancer. CANCER LETTERS

[9] IF8.469 A novel 3’tRNA-derived fragment tRF-Val promotes proliferation and inhibits apoptosis by targeting EEF1A1 in gastric cancer. Cell Death & Disease

[10] IF8.469 SF3B4 promotes ovarian cancer progression by regulating alternative splicing of RAD52. Cell Death & Disease

[11] IF8.469 Linc-ROR facilitates progression and angiogenesis of hepatocellular carcinoma by modulating DEPDC1 expression. Cell Death & Disease

[12] IF8.469 A new candidate oncogenic lncRNA derived from pseudogene WFDC21P promotes tumor progression in gastric cancer. Cell Death & Disease

[13] IF8.469 HNRNPA1-mediated exosomal sorting of miR-483-5p out of renal tubular epithelial cells promotes the progression of diabetic nephropathy-induced renal interstitial fibrosis. Cell Death & Disease

1. 可以做膜蛋白或核蛋白的RIP吗？

为了不影响内源蛋白与RNA的互作，RIP裂解液裂解作用较温和。已有实验实例证明，RIP裂解液可以裂解开胞膜及核膜，释放胞内及核内蛋白，但与DNA及细胞膜紧密结合的蛋白无法裂解释放出来，因此不适用于DNA与膜结合的蛋白RIP。

2. 为什么RIP试剂盒提出来的RNA浓度很低，正常吗？

RIP产物量一般都不足以直接测量出浓度，可通过定量RT-PCR（如果已知RBP的结合靶基因），或通过测序技术进行分析。

做qPCR分析时，由于RNA浓度未知，可取所用反转录体系的最大上样量进行逆转录。测序时，如一次实验产物量不够建库，可重复实验，合并产物，也可适当提高初始样本量。

3. 试剂盒RIP RNA产物分析是定量还是半定量式分析？

是半定量分析，以Ip、Igg组相对表达差异倍数来判断是否有结合作用。

4. RIP说明书说的5ug抗体是怎么计算的？

抗体说明书中有质量浓度的话可以进行换算。如无，可按说明书中建议的体积量使用。

5. 在RIP实验中，IP和WB使用的抗体需要来源于不同的种属吗？

在RIP实验中，IP和WB使用的抗体最好来源于不同的种属，否则在跑WB时，会在55KD和25KD的位置出现较强的重链和轻链，影响目的蛋白的曝光。

详细内容可参考：

如何避免IP检测过程中的重链干扰与轻链干扰_中国生物器材网 (bio-equip.com)

如何避免免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation, Co-IP)中的igG交叉污染 - 百度文库 (baidu.com)

6. RIP中蛋白提取步骤中用到的丙酮有替代品吗?

丙酮适用本试剂盒说明书中的实验操作。客户也可用其它方法进行蛋白沉淀提取。

7. BufferE加入β-巯基乙醇后出现白色絮状沉淀，正常吗？

正常。室温平衡一会即可，即使仍有白色沉淀也不影响使用。

8. RIP结果WB检测正常，IP、Igg两组ct值几乎无差异说明什么？

说明目的蛋白与目标基因无特异性结合。

9. RIP试剂盒适用于裂解细菌吗？

细菌样本用液氮速冻研磨后，再进行这些裂解步骤即可。

10. MeRIP和RIP技术或试剂盒可以通用吗？

MeRIP和RIP，虽然核心原理一样，但两个技术的实验方法、流程、所用抗体以及应用都是不一样的，不能通用。

了解更多：

https://mp.weixin.qq.com/s/S84RXllkC0CegN61EZ84hA

https://mp.weixin.qq.com/s/520lOrEJrqZV7XutP4KE_Q