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RIP试剂盒
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9 RIP Kit 12T.jpg


RNA Immunoprecipitation RIP)是研究细胞内RNA与蛋白结合的一种实验技术,运用针对目标蛋白的抗体目的蛋白以及与之结合的RNA沉淀下来,经过分离纯化就可以对复合物中的RNA进行 MicroarrayRIP-chip),定量RT-PCR或高通量测序(RIP-Seq)检测分析。本试剂包含RIP实验所需的全套试剂,以及RIP产物的提取试剂,让实验更加轻松快捷

产品信息

产品名称

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PureBinding®RNA Immunoprecipitation Kit

P0101

12 rxns

2680

-20℃~4℃

P0102

24 rxns

4980


产品特点
        1.方便快捷:试剂盒成分完整,包含RIP和提取整套试剂,5小时即可完成。
        2.体系稳定:捕获效率高,实验体系稳定,重复性高。


应用范围

        1.与目标蛋白结合的RNA及其他相互作用蛋白分析;
        2.RBP结合RNA motif鉴定;

        3 不适用膜结合蛋白、DNA结合蛋白(组蛋白、核仁蛋白等)的RIP实验。

实验流程



RIP实验的目的是分析与目的蛋白结合的RNA,原理则是运用针对目的蛋白的抗体把相应的RNA-蛋白复合物沉淀下来,经过分离纯化并对结合在复合物上的RNA进行测序或PCR分析。

2016年9月23日,意大利Maria R. Matarazzo教授Methods in Molecular Biology杂志介绍了RIP实验的经典操作方法。文中介绍的RIP实验操作流程如下图所示:



图1 经典RIP实验操作流程(来自[1]


RIP实验有哪些应用呢?大家都知道RNA是一种不稳定的生物大分子,绝大多数RNA都需要与特定的RNA结合蛋白形成RNA-蛋白复合物才能稳定存在于细胞中。RNA-蛋白复合物驱动了几乎所有细胞过程的基因表达的转录后调控,包括剪接(splicing)、出核转运(nuclear export)、mRNA稳定性以及蛋白转译过程。因此,对基因调控的了解就有赖于确定这些过程中RNA的结合的变化,RIP技术应运而生,可应用于研究miRNA调节靶点、RNA与RNP(RNA结合蛋白)的互作关系等。


案例1

RIP用于研究circRNA与蛋白互作

2022年3月29号,重庆医科大学的陈俊霞教授Mol Cancer发表文章Hypoxia-induced circWSB1 promotes breast cancer progression through destabilizing p53 by interacting with USP10本研究揭示了一种新的机制,即缺氧诱导的circWSB1可以与USP10相互作用,从而减弱USP10介导的p53稳定并促进BC的进展,为BC提供了一种替代的预后生物标记物和治疗靶点。

已有报道发现,环状RNA通过miRNA海绵机制参与缺氧的调控。几乎所有这些与缺氧相关的circRNA都起到了miRNA海绵的作用,环状RNA同样可以通过结合蛋白以及翻译多肽发挥功能。作者使用pull-down对环状RNA的结合产物进行分析,虽然没有发现P53,但是作者发现泛素化酶USP10与circWBS1相互结合。使用数据库对二者的结合位点进行了预测。设计USP10的全长和缺失突变体并插入Flag标签(图2),通过RIP实验(使用吉赛生物RIP试剂盒)对USP10与circWBS1的结合进行了验证。


案例2

RIP用于研究lncRNA与蛋白互作


图4 lncRNA和编码RNA与EZH2结合能力的比较(来自[3]


在本研究中,使用EZH2特异性抗体对人胃癌细胞系MKN45和AGS,以及对照细胞系GES-1进行RIP-seq,分析了8256个与EZH2相关的RNAs,包括编码和非编码RNAs,其中MALAT1在MKN45细胞系中高表达。并且发现MALAT1通过和EZH2相互作用,抑制原钙黏蛋白因子10(PCDH10)的表达,从而促进胃癌细胞的侵袭和转移[3]


案例3

RIP用于研究miRNA与蛋白互作


图5 缺铁性和非缺血性NPCs中isomiRs分析(来自[4]


在本研究中,利用Ago2 RIP-seq,分析非缺血性和缺血性成年大鼠侧脑室下区(SVZ)的神经祖细胞(NPCs)miRNAs的表达情况[4]


结果显示,相较于非缺血性NPCs,中风改变了NPCs中Ago2相关的miRNAs表达,缺血性NPCs中的isomiRsreads数增加,其中5'末端添加核苷酸的isomiR-142-5p_L+2R-1显著上调,5'末端缺失核苷酸的isomiR-187-5p_L-2R+3显著下调[4]



案例解析参考文献

1.RIP: RNA Immunoprecipitation.Methods Mol Biol, 2016. 1480: p. 73-86.

2.Hypoxia-induced circWSB1 promotes breast cancer progression through destabilizing p53 by interacting with USP10[J]. Molecular Cancer, 2022, 21(1):1-20.

3.MALAT1 long ncRNA promotes gastric cancer metastasis by suppressing PCDH10.Oncotarget. 2016 Mar 15; 7(11): 12693–12703.

4.Identification of miRNomes associated with adult neurogenesis after stroke using Argonaute 2-based RNA sequencing.RNA Biol. 2017; 14(5): 488–499.



[1] IF27.401 The circACTN4 interacts with FUBP1 to promote tumorigenesis and progression of breast cancer by regulating the expression of proto-oncogene MYC. Molecular Cancer


[2] IF17.388 N6-methyladenosine reader IMP2 stabilizes the ZFAS1/OLA1 axis and activates the Warburg effect: implication in colorectal cancer. Journal of Hematology & Oncology


[3] IF14.919 The genomic landscape of cholangiocarcinoma reveals the disruption of post-transcriptional modifiers. Nature Communications


[4] IF11.161 A novel lncRNA ARST represses glioma progression by inhibiting ALDOA-mediated actin cytoskeleton integrity. JOURNAL OF EXPERIMENTAL & CLINICAL CANCER RESEARCH


[5] IF9.261 Mettl14 mediates the inflammatory response of macrophages in atherosclerosis through the NF-κB/IL-6 signaling pathway. CELLULAR AND MOLECULAR LIFE SCIENCES


[6] IF8.886 ac4C acetylation of RUNX2 catalyzed by NAT10 spurs osteogenesis of BMSCs and prevents ovariectomy-induced bone loss. Molecular Therapy-Nucleic Acids


[7] IF8.718 The m6A reader IGF2BP3 promotes acute myeloid leukemia progression by enhancing RCC2 stability. EXPERIMENTAL AND MOLECULAR MEDICINE


[8] IF8.679 IGF2BP2-dependent activation of ERBB2 signaling contributes to acquired resistance to tyrosine kinase inhibitor in differentiation therapy of radioiodine-refractory papillary thyroid cancer. CANCER LETTERS


[9] IF8.469 A novel 3’tRNA-derived fragment tRF-Val promotes proliferation and inhibits apoptosis by targeting EEF1A1 in gastric cancer. Cell Death & Disease


[10] IF8.469 SF3B4 promotes ovarian cancer progression by regulating alternative splicing of RAD52. Cell Death & Disease


[11] IF8.469 Linc-ROR facilitates progression and angiogenesis of hepatocellular carcinoma by modulating DEPDC1 expression. Cell Death & Disease


[12] IF8.469 A new candidate oncogenic lncRNA derived from pseudogene WFDC21P promotes tumor progression in gastric cancer. Cell Death & Disease


[13] IF8.469 HNRNPA1-mediated exosomal sorting of miR-483-5p out of renal tubular epithelial cells promotes the progression of diabetic nephropathy-induced renal interstitial fibrosis. Cell Death & Disease


吉赛生物PureBinding®RNA Immunoprecipitation Kit Cat.No. P0101P0102.pdf
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1. 可以做膜蛋白或核蛋白的RIP吗?

为了不影响内源蛋白与RNA的互作,RIP裂解液裂解作用较温和。已有实验实例证明,RIP裂解液可以裂解开胞膜及核膜,释放胞内及核内蛋白,但与DNA及细胞膜紧密结合的蛋白无法裂解释放出来,因此不适用于DNA与膜结合的蛋白RIP。



2. 为什么RIP试剂盒提出来的RNA浓度很低,正常吗?

RIP产物量一般都不足以直接测量出浓度,可通过定量RT-PCR(如果已知RBP的结合靶基因),或通过测序技术进行分析。

做qPCR分析时,由于RNA浓度未知,可取所用反转录体系的最大上样量进行逆转录。测序时,如一次实验产物量不够建库,可重复实验,合并产物,也可适当提高初始样本量。



3. 试剂盒RIP RNA产物分析是定量还是半定量式分析?

是半定量分析,以Ip、Igg组相对表达差异倍数来判断是否有结合作用。



4. RIP说明书说的5ug抗体是怎么计算的?

抗体说明书中有质量浓度的话可以进行换算。如无,可按说明书中建议的体积量使用。



5. 在RIP实验中,IP和WB使用的抗体需要来源于不同的种属吗?

在RIP实验中,IP和WB使用的抗体最好来源于不同的种属,否则在跑WB时,会在55KD和25KD的位置出现较强的重链和轻链,影响目的蛋白的曝光。

详细内容可参考:

如何避免IP检测过程中的重链干扰与轻链干扰_中国生物器材网 (bio-equip.com)

如何避免免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation, Co-IP)中的igG交叉污染 - 百度文库 (baidu.com)



6. RIP中蛋白提取步骤中用到的丙酮有替代品吗?

丙酮适用本试剂盒说明书中的实验操作。客户也可用其它方法进行蛋白沉淀提取。



7. BufferE加入β-巯基乙醇后出现白色絮状沉淀,正常吗?

正常。室温平衡一会即可,即使仍有白色沉淀也不影响使用。



8. RIP结果WB检测正常,IP、Igg两组ct值几乎无差异说明什么?

说明目的蛋白与目标基因无特异性结合。



9. RIP试剂盒适用于裂解细菌吗?

细菌样本用液氮速冻研磨后,再进行这些裂解步骤即可。



10. MeRIP和RIP技术或试剂盒可以通用吗?

MeRIP和RIP,虽然核心原理一样,但两个技术的实验方法、流程、所用抗体以及应用都是不一样的,不能通用。



了解更多:

https://mp.weixin.qq.com/s/S84RXllkC0CegN61EZ84hA

https://mp.weixin.qq.com/s/520lOrEJrqZV7XutP4KE_Q



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