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全转录组测序 | RNA-seq
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常见问题

   全转录组测序服务主要针对circRNAlncRNAmRNA,一举三得,一次测序可以同时得到三者分子的表达情况,可应用于新circRNAlncRNA预测以及已知circRNAlncRNA表达水平研究等。


全转录组测序技术路线



测序方案

测序平台Illumina Novaseq 6000

测序模式PE150
测序数据量10 Gb


        竞争性内源RNA网络揭示了肺癌的复杂分子机制

        Crosstalk in competing endogenous RNA network reveals the complex molecular mechanism underlying lung cancer

        Oncotarget, 2017, Vol. 8, (No. 53), pp: 91270-91280

        IF5.168

        测序策略:全转录组测序(包含miRNA测序)

        样本分组:18对肺癌患者外周血及正常人外周血样本,每3例病症相似的样本混合后进行RNA抽提,测序样本为病人组6例及正常组6例,3对用于miRNA测序,3对用于全转录组测序。


        作者研究了肺癌发展的转录机制。本研究对肺癌病例组及健康对照组血液样本进行RNA测序分析,识别了一系列差异表达的miRNAcircRNAmRNAlncRNA,并进行了通路富集分析。基于miRNA靶向基因作用,建立起竞争性内源RNA互作网络,并筛选出重要节点。在肺癌患者中有59miRNA18306个基因,232lncRNA292circRNA的表达发生显著改变(图1)。这些miRNA与癌症的通路、结直肠癌及癌症的转录错误调控等癌症相关的通路紧密相关。此外,差异表达的基因显著富集在嗅觉转导和神经活性配体受体相互作用这两条新的通路上(图2)。在竞争性内源RNA网络中发现了5个中枢miRNA(图3),其中在hsa-miR-582-3p hsa-miR-582-5pWnt信号通络中显著富集,且存在于转录因子调节网络中;hsa-miR-665MAPK信号通路密切相关。WT1ETV1的转录因子分别由hsa-miR-657 hsa-miR-582-5p调控,并调控雄激素受体基因表达。miR-582-5pmiRNA-582-3pmiR-657可能在肺肿瘤的发展中起重要的调节作用。本研究探索了肺癌发病的新机制,助力新疗法的发展。

1RNA高通量测序数据热图

A:病人组与正常组miRNA差异表达热图

B:病人组与正常组circRNA差异表达热图


2:差异表达基因及miRNA相关通路富集分析

3miRNA, circRNA, lncRNAmRNA竞争性内源RNA网络互作图







生物信息分析

原始数据质控检查

比对结果质控检查

基因覆盖度分析

基于基因表达的样品主成分分析

基因表达分析

差异基因表达分析

差异基因GO功能分析

差异基因KEGG通路分析

差异基因Rectome通路分析

针对mRNA基因GSEA分析

circRNA预测及鉴定

circRNA差异分析

差异circRNA宿主基因的GO功能分析

差异circRNA宿主基因的KEGG通路分析

差异circRNA宿主基因的Rectome通路分析

差异circRNA的靶向miRNA预测分析

差异circRNA及靶向miRNA网络调控制图

长链非编码RNA的识别

长链非编码RNA差异分析

差异lncRNA顺式调控基因的GO功能分析

差异lncRNA顺式调控基因的KEGG通路分析

差异lncRNA顺式调控基因的Rectome通路分析


可选分析

基因可变剪切分析(测序数据量为15Gb


部分结果展示

1差异基因及差异lncRNA的热图、火山图


2ceRNA调节网络


3差异表达的mRNAlncRNAcircRNA的功能富集分析


4单个可变剪切事件sashimi plot


5可变剪切事件数目统计展示



Table1.RNA-seq原始样本送样建议

送样类型
送样量
备注
细胞(细胞数)
≥1*10^6
无支原体污染
动物组织
≥100mg
 
植物组织
≥100mg
 
全血
≥4mL
 
FFPE
8-10片,未染色,厚度10μm
 


Table2.RNA-seq RNA样本送样建议

送样类型
送样量
完整性(RIN值)
浓度
其他
纯度
total RNA(组织、细胞、全血等)
≥1μg
≥7
≥100ng/μl
 
无DNA,蛋白/盐离子等污染,样本无色透明不粘稠
血清血浆、细胞上清、外泌体RNA
≥200ng,如≤10ng,则采用微量建库
/
/
 

FFPE组织RNA
≥2μg
≥3
/
DV200>30%


*更具体的送样方法请详询销售或技术支持

物种范围:人、小鼠、大鼠等哺乳动物,拟南芥、水稻、番茄、玉米、大豆等植物,其他物种详询销售或技术支持



Q1:常规的细胞或组织样本与血清/血浆、外泌体、FFPE等特殊样本在做全转录组测序时数据质量是否有不同?

A1:会有不同。常规细胞或组织样本抽提出来的RNA质量较高,建库起始量足够,测序数据质量较好,一般有效数据mapping率85%以上;而血清/血浆、外泌体、FFPE等特殊样本RNA降解程度较高,浓度低,建库起始量不足,测序数据质量较差,一般有效数据mapping率50%左右。


Q2:为什么常规全转录组测序要先去除rRNA?

A2:核糖体RNA的遗传信息的保守性较高,在不同组织、器官中也十分稳定,研究者更倾向于研究信息含量更为丰富的mRNA、非编码RNA以及circRNA等。在抽提所得的总RNA中,80%以上都是核糖体RNA,如采用Oligo dT磁珠捕获mRNA则会丢失不含polyA尾的lincRNA、circRNA等。因此,采用去除rRNA的建库方式能最大程度地保留转录组RNA信息,提高测序有效数据量。





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