案例1：

南京中医药大学的顾春艳教授和杨烨教授，海军医科大学的杜鹃主任医师，在Journal of Experimental & Clinical Cancer Research联合发表文章A novel protein encoded by circHNRNPU promotes multiple myeloma progression by regulating the bone marrow microenvironment and alternative splicing，研究结果表明，circHNRNPU_603aa在MM细胞和BM中都是一种很有前途的诊断和治疗标记物。

在本文研究中，作者分别对circHNRNPU_603aa的内源和外源表达进行了验证。如图1E所示，使用吉赛生物的翻译载体系统，对circHNRNPU_603aa的外源表达进行细胞内验证。功能实验发现，过表达circhRNPU可以促进骨髓瘤细胞的功能，而针对特定肽段敲低的siRNA可以抑制骨髓瘤细胞的功能。既circHNRNPU_603aa促进MM发展的作用，并进行成瘤实验验证了它的这种功能。

图1. CirchRNPU编码一种新的HRNPU亚型

案例2：

金哲教授（深圳大学），秦颖副主任医师（深圳市第二人民医院）和Song Li（深圳市科技发展交流中心）共同通讯在Mol Cancer发表文章A novel protein AXIN1-295aa encoded by circAXIN1 activates the Wnt/β-catenin signaling pathway to promote gastric cancer progression。研究发现，相比于相邻正常胃组织，circAXIN1在GC组织中高表达。CircAXIN1编码一种295个氨基酸（aa）的新蛋白质，命名为AXIN1-295aa。

本文研究中，作者对五对GC样本进行高通量测序，差异表达的circAXIN1被提示编码一种新的蛋白质。CircAXIN1编码一种新的蛋白质AXIN1-295aa。如图1所示，作者分别使用在过表达载体中插入Flag标签以及插入EMCV IRES序列的Luc2报告载体两种方式，验证了circAXIN1的翻译。（T系列和R系列circRNA翻译验证载体由广州吉赛生物提供）。

图1. CircAXIN1编码AXIN1-295aa的验证

参考文献：

1. A novel protein encoded by circHNRNPU promotes multiple myeloma progression by regulating the bone marrow microenvironment and alternative splicing J Exp Clin Cancer Res. 2022 Mar 8;41(1):85.

过表达载体构建及鉴定：

以PCR扩增hsa_circ_00AAAA-3xFlag的全长***bp序列，In-Fusion克隆连接到pLC5-ciR中。

图1 pLC5-ciR载体图谱

    载体测序引物：pC5-seqF: TGTGAATTTGACCCTTAAGA

                            pC5-seqR: TCCTCTCTTGATTTCCTTATT

测序峰图正常，无杂峰或叠带，序列对比吻合，表明hsa_circ_00AAAA-3xFlag成功插入pLC5-ciR中，过表达载体构建成功

qPCR验证转染后表达效率：

qPCR产物测序结果：

注：hsa_circ_00AAAA在circBase中的环化位点序列NNNNAGNNNN

结论：

相比于对照组，CAAAAA组的过表达倍数为***；PCR产物测序峰图正常，无杂峰或叠带，序列与环化位点参考序列对比吻合。以上结果表明CAAAAA能在真核细胞中成功过表达目的hsa_circ_00AAAAA。

1. T3载体构建，只突变起始密码子ATG不删除后面的ATG会有影响吗？

现有文章都是使用突变以减少对蛋白结构的改变，后续其他ATG删除的话会大大影响蛋白的结构，可能会引起不必要的改变。而且翻译是很复杂的机制，并不是遇见ATG就起始翻译，还需要其他序列协助才可以。