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T系列-circRNA翻译验证
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circRNA翻译验证载体示意图



T1 circRNA-OEcircRNA过表达载体

使用吉赛生物专利技术的第五代circRNA过表达载体进行构建,利用载体携带的侧翼成环框架(IR)使插入的circRNA序列准确剪切成环表达。包含细胞转染和qRT-PCR检测,保证插入的circRNA序列准确剪切成环过表达。


T2circRNA-3xFlag3xFlag标签的circRNA过表达载体

circRNA-OE载体的基础上,于预测ORF的终止密码子前添加3xFlag标签序列,利用载体携带的侧翼成环框架(IR)使插入的含3xFlag标签的circRNA序列准确剪切成环表达。包含细胞转染和qRT-PCR检测,保证插入的circRNA序列准确剪切成环过表达。


T3circRNA-3xFlag-△ATG(含3xFlag标签并删除ATGcircRNA过表达载体)

circRNA-3xFlag载体的基础上,删除预测ORF的起始密码子ATG,利用载体携带的侧翼成环框架(IR)使插入的含3xFlag标签的circRNA序列准确剪切成环表达。


T4circRNA-3xFlag-NC3xFlag标签并删除下游IR的载体,即不能成环的阴性对照

circRNA-3xFlag载体的基础上,删除载体下游的成环框架(IR),使能转录生成与circRNA-3xFlag相同的RNA序列但不剪切成环。该载体可作为阴性对照使用。


T5circRNA-3xFlag-**aa预测ORF的线性表达载体,即**aa的阳性对照

使用与吉赛生物专利技术的第五代circRNA过表达载体相同骨架(不含成环框架)的载体进行构建,插入预测的ORF全长,使能转录生成线性化的ORF全长序列,并能正常翻译生成预测的多肽**aa。该载体可作为阳性对照使用。


客户提供

1. 指定载体名称;

2. circRNA名称(ID)、物种&已预测的ORF序列信息。


交付标准

每个载体提供2 μg粒,200 μL甘油菌

案例1:

南京中医药大学的顾春艳教授和杨烨教授,海军医科大学的杜鹃主任医师,在Journal of Experimental & Clinical Cancer Research联合发表文章A novel protein encoded by circHNRNPU promotes multiple myeloma progression by regulating the bone marrow microenvironment and alternative splicing,研究结果表明,circHNRNPU_603aa在MM细胞和BM中都是一种很有前途的诊断和治疗标记物。


在本文研究中,作者分别对circHNRNPU_603aa的内源和外源表达进行了验证。如图1E所示,使用吉赛生物的翻译载体系统,对circHNRNPU_603aa的外源表达进行细胞内验证。功能实验发现,过表达circhRNPU可以促进骨髓瘤细胞的功能,而针对特定肽段敲低的siRNA可以抑制骨髓瘤细胞的功能。既circHNRNPU_603aa促进MM发展的作用,并进行成瘤实验验证了它的这种功能。



图1. CirchRNPU编码一种新的HRNPU亚型


案例2:


金哲教授(深圳大学),秦颖副主任医师(深圳市第二人民医院)和Song Li(深圳市科技发展交流中心)共同通讯在Mol Cancer发表文章A novel protein AXIN1-295aa encoded by circAXIN1 activates the Wnt/β-catenin signaling pathway to promote gastric cancer progression。研究发现,相比于相邻正常胃组织,circAXIN1在GC组织中高表达。CircAXIN1编码一种295个氨基酸(aa)的新蛋白质,命名为AXIN1-295aa。

本文研究中,作者对五对GC样本进行高通量测序,差异表达的circAXIN1被提示编码一种新的蛋白质。CircAXIN1编码一种新的蛋白质AXIN1-295aa。如图1所示,作者分别使用在过表达载体中插入Flag标签以及插入EMCV IRES序列的Luc2报告载体两种方式,验证了circAXIN1的翻译。(T系列和R系列circRNA翻译验证载体由广州吉赛生物提供)。

图1. CircAXIN1编码AXIN1-295aa的验证



参考文献:

1. A novel protein encoded by circHNRNPU promotes multiple myeloma progression by regulating the bone marrow microenvironment and alternative splicing J Exp Clin Cancer Res. 2022 Mar 8;41(1):85.

2. A novel protein AXIN1-295aa encoded by circAXIN1 activates the Wnt/β-catenin signaling pathway to promote gastric cancer progression. Mol Cancer .2021 Dec 4;20(1):158.






过表达载体构建及鉴定:

以PCR扩增hsa_circ_00AAAA-3xFlag的全长***bp序列,In-Fusion克隆连接到pLC5-ciR中。

图1 pLC5-ciR载体图谱

    载体测序引物:pC5-seqF: TGTGAATTTGACCCTTAAGA

                            pC5-seqR: TCCTCTCTTGATTTCCTTATT


测序峰图正常,无杂峰或叠带,序列对比吻合,表明hsa_circ_00AAAA-3xFlag成功插入pLC5-ciR中,过表达载体构建成功


qPCR验证转染后表达效率:


qPCR产物测序结果:

注:hsa_circ_00AAAA在circBase中的环化位点序列NNNNAGNNNN


结论:

相比于对照组,CAAAAA组的过表达倍数为***;PCR产物测序峰图正常,无杂峰或叠带,序列与环化位点参考序列对比吻合。以上结果表明CAAAAA能在真核细胞中成功过表达目的hsa_circ_00AAAAA。










1. T3载体构建,只突变起始密码子ATG不删除后面的ATG会有影响吗?

现有文章都是使用突变以减少对蛋白结构的改变,后续其他ATG删除的话会大大影响蛋白的结构,可能会引起不必要的改变。而且翻译是很复杂的机制,并不是遇见ATG就起始翻译,还需要其他序列协助才可以。


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