circRNA qPCR引物设计circRNA qPCR检测circRNA表达分析circRNA过表达实验circRNA干扰实验细胞功能实验慢病毒包装circRNA功能分析T系列-circRNA翻译验证R系列-IRES活性检测circRNA翻译-验证研究circRNA注释及功能预测circRNA荧光素酶报告检测circRNA RIP实验circRNA pull-down实验circRNA相互作用组学研究circRNA FISH探针合成circRNA定位分析circRNA全长纳米孔测序 | ONT circRNA full-length Sequencin三代测序全转录组测序 | RNA-seqcircRNA测序 | circRNA-seqmRNA测序 | mRNA-seq小RNA测序 | miRNA-seq转录组学研究核糖体印迹测序 | Ribo-seq核糖体-新生肽链复合物测序 | RNC-seq翻译组学研究RNA m6A甲基化测序 | MeRIP-Seq染色质开放性测序 | ATAC-seq表观组学研究10×Visium空间转录组测序空间转录组学研究外泌体RNA测序 | Exosome RNA-seq外泌体提取及鉴定外泌体研究RNA免疫共沉淀测序 | RIP-seq染色质免疫共沉淀测序 | ChIP-seq核酸蛋白互作研究微生物宏基因组测序 | Metagenomics Sequencing基因组学研究生物医学大数据挖掘分析circRNA定制化分析及绘图常规组学及多组学联合分析单细胞测序数据生信分析生物信息学分析服务RNase RcircRNA qRT-PCR试剂盒circRNA检测circRNA过表达系列circRNA过表达载体系列血液基因组DNA提取试剂盒全血RNA提取试剂盒细胞RNA提取试剂盒核酸提取与纯化RNA pull-down试剂盒RIP试剂盒T7转录试剂盒(生物素标记)分子互作系列外泌体提取试剂盒Taqman探针法支原体检测试剂盒(UNG防污染版)支原体检测核糖体RNA去除试剂盒(人/大鼠/小鼠)核糖体RNA去除试剂盒(植物)RNA-seq文库构建试剂盒RNA建库接头试剂DNA磁珠RNA磁珠高通量测序系列circRNA标准品系列CircLucT7耐高温高产量RNA合成试剂盒环状RNA合成试剂盒T4 RNA连接酶1T4 RNA连接酶2circRNA制备系列原位杂交系列原位杂交系列
T系列-circRNA翻译验证
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circRNA翻译验证载体示意图



T1 circRNA-OEcircRNA过表达载体

使用吉赛生物专利技术的第五代circRNA过表达载体进行构建,利用载体携带的侧翼成环框架(IR)使插入的circRNA序列准确剪切成环表达。包含细胞转染和qRT-PCR检测,保证插入的circRNA序列准确剪切成环过表达。


T2circRNA-3xFlag3xFlag标签的circRNA过表达载体

circRNA-OE载体的基础上,于预测ORF的终止密码子前添加3xFlag标签序列,利用载体携带的侧翼成环框架(IR)使插入的含3xFlag标签的circRNA序列准确剪切成环表达。包含细胞转染和qRT-PCR检测,保证插入的circRNA序列准确剪切成环过表达。


T3circRNA-3xFlag-△ATG(含3xFlag标签并删除ATGcircRNA过表达载体)

circRNA-3xFlag载体的基础上,删除预测ORF的起始密码子ATG,利用载体携带的侧翼成环框架(IR)使插入的含3xFlag标签的circRNA序列准确剪切成环表达。


T4circRNA-3xFlag-NC3xFlag标签并删除下游IR的载体,即不能成环的阴性对照

circRNA-3xFlag载体的基础上,删除载体下游的成环框架(IR),使能转录生成与circRNA-3xFlag相同的RNA序列但不剪切成环。该载体可作为阴性对照使用。


T5circRNA-3xFlag-**aa预测ORF的线性表达载体,即**aa的阳性对照

使用与吉赛生物专利技术的第五代circRNA过表达载体相同骨架(不含成环框架)的载体进行构建,插入预测的ORF全长,使能转录生成线性化的ORF全长序列,并能正常翻译生成预测的多肽**aa。该载体可作为阳性对照使用。


客户提供

1. 指定载体名称;

2. circRNA名称(ID)、物种&已预测的ORF序列信息。


交付标准

每个载体提供2 μg粒,200 μL甘油菌

案例1:

南京中医药大学的顾春艳教授和杨烨教授,海军医科大学的杜鹃主任医师,在Journal of Experimental & Clinical Cancer Research联合发表文章A novel protein encoded by circHNRNPU promotes multiple myeloma progression by regulating the bone marrow microenvironment and alternative splicing,研究结果表明,circHNRNPU_603aa在MM细胞和BM中都是一种很有前途的诊断和治疗标记物。


在本文研究中,作者分别对circHNRNPU_603aa的内源和外源表达进行了验证。如图1E所示,使用吉赛生物的翻译载体系统,对circHNRNPU_603aa的外源表达进行细胞内验证。功能实验发现,过表达circhRNPU可以促进骨髓瘤细胞的功能,而针对特定肽段敲低的siRNA可以抑制骨髓瘤细胞的功能。既circHNRNPU_603aa促进MM发展的作用,并进行成瘤实验验证了它的这种功能。



图1. CirchRNPU编码一种新的HRNPU亚型


案例2:


金哲教授(深圳大学),秦颖副主任医师(深圳市第二人民医院)和Song Li(深圳市科技发展交流中心)共同通讯在Mol Cancer发表文章A novel protein AXIN1-295aa encoded by circAXIN1 activates the Wnt/β-catenin signaling pathway to promote gastric cancer progression。研究发现,相比于相邻正常胃组织,circAXIN1在GC组织中高表达。CircAXIN1编码一种295个氨基酸(aa)的新蛋白质,命名为AXIN1-295aa。

本文研究中,作者对五对GC样本进行高通量测序,差异表达的circAXIN1被提示编码一种新的蛋白质。CircAXIN1编码一种新的蛋白质AXIN1-295aa。如图1所示,作者分别使用在过表达载体中插入Flag标签以及插入EMCV IRES序列的Luc2报告载体两种方式,验证了circAXIN1的翻译。(T系列和R系列circRNA翻译验证载体由广州吉赛生物提供)。

图1. CircAXIN1编码AXIN1-295aa的验证



参考文献:

1. A novel protein encoded by circHNRNPU promotes multiple myeloma progression by regulating the bone marrow microenvironment and alternative splicing J Exp Clin Cancer Res. 2022 Mar 8;41(1):85.

2. A novel protein AXIN1-295aa encoded by circAXIN1 activates the Wnt/β-catenin signaling pathway to promote gastric cancer progression. Mol Cancer .2021 Dec 4;20(1):158.






过表达载体构建及鉴定:

以PCR扩增hsa_circ_00AAAA-3xFlag的全长***bp序列,In-Fusion克隆连接到pLC5-ciR中。

图1 pLC5-ciR载体图谱

    载体测序引物:pC5-seqF: TGTGAATTTGACCCTTAAGA

                            pC5-seqR: TCCTCTCTTGATTTCCTTATT


测序峰图正常,无杂峰或叠带,序列对比吻合,表明hsa_circ_00AAAA-3xFlag成功插入pLC5-ciR中,过表达载体构建成功


qPCR验证转染后表达效率:


qPCR产物测序结果:

注:hsa_circ_00AAAA在circBase中的环化位点序列NNNNAGNNNN


结论:

相比于对照组,CAAAAA组的过表达倍数为***;PCR产物测序峰图正常,无杂峰或叠带,序列与环化位点参考序列对比吻合。以上结果表明CAAAAA能在真核细胞中成功过表达目的hsa_circ_00AAAAA。










1. T3载体构建,只突变起始密码子ATG不删除后面的ATG会有影响吗?

现有文章都是使用突变以减少对蛋白结构的改变,后续其他ATG删除的话会大大影响蛋白的结构,可能会引起不必要的改变。而且翻译是很复杂的机制,并不是遇见ATG就起始翻译,还需要其他序列协助才可以。


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