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R系列-IRES活性检测
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IRES验证载体示意图

R1Empty VectorLuc2空载体

Luc2报告载体是基于海肾荧光素酶(Renilla Luciferase, R-Luc)和萤火虫荧光素酶(Firefly Luciferase, F-Luc)的cap-independent translation报告载体,R-Luc5’ m7G帽子结构介导翻译起始,F-Luc只在插入有IRESInternal Ribosome Entry Site)活性的序列或能介导翻译起始的序列时可以翻译。Luc2空载体含有多克隆酶切位点,命名为Luc2-IRES- Report


R2EMCV IRES插入EMCV IRES序列的Luc2报告载体阳性对照

Luc2阳性对照载体含有EMCV IRES序列,命名为Luc2-EMCV-IRES-Report


R3IRES插入预测IRES序列的Luc2报告载体

使用Luc2-IRES-Report载体进行构建,插入预测的IRES序列全长。


R4IRES-Del1插入预测IRES前半部分序列的Luc2报告载体

使用Luc2-IRES-Report载体进行构建,插入部分预测的IRES序列(已删除后半部分)。


R5IRES-Del2 (插入预测IRES后半部分序列的Luc2报告载体)

使用Luc2-IRES-Report载体进行构建,插入部分预测的IRES序列(已删除前半部分)。


客户提供

circRNA名称(ID)、物种&已预测的IRES序列信息及序列删减要求信息。


交付标准

每个载体提供2 μg质粒,200 μL甘油菌



我们都知道,经典的翻译要依赖于m7G帽子结构,而环状的结构让 circRNA 只能通过非经典的方式启动翻译,包括通过 IRES(Internal Ribosome Entry Site)介导 circRNA 的翻译起始。

案例1:


2019年12月21日,俄克拉荷马大学Chuanbin Mao和上海第四人民医院/长海医院刘善荣教授为共同通讯作者在ADVANCED SCIENCE (IF= 15.804)杂志上发表了一篇题为“Circ-MALAT1 Functions as Both an mRNA Translation Brake and a microRNA Sponge to Promote Self-Renewal of Hepatocellular Cancer Stem Cells”的文章,报道在肝癌肿瘤干细胞(CSC)中发现了高表达的环状RNA,circ-MALAT1。该分子通过两种方式发挥功能:一方面,circ-MALAT1通过海绵miRNA(miR-6887-3p)上调癌基因(JAK2)和增加磷酸化JAK2,增强JAK2/STAT3信号通路,从而积极地促进CSC的自我更新:另一方面,circ-MALAT1可以通过抑制mRNA翻译过程,直接抑制PAX5 mRNA的翻译,这种mRNA Translation Brake是一种全新的circRNA功能机制形式,值得关注([1])。



图1 circ-MALAT1作为mRNA Brake抑制PAX5翻译

本文研究中,circ-MALAT1上有两个IRES和一个含有11个碱基的区域。RIP、qRT-PCR、RNA pull down、IRES和11个碱基突变实验证实了circ-MALAT1分别通过IRES和11个碱基与核糖体和PAX5 mRNA 形成三元复合物来阻止PAX5的翻译,并且这种结合具有序列特异性。

案例2:


金哲教授(深圳大学),秦颖副主任医师(深圳市第二人民医院)和Song Li(深圳市科技发展交流中心)共同通讯在Mol Cancer发表文章A novel protein AXIN1-295aa encoded by circAXIN1 activates the Wnt/β-catenin signaling pathway to promote gastric cancer progression。研究发现,相比于相邻正常胃组织,circAXIN1在GC组织中高表达。CircAXIN1编码一种295个氨基酸(aa)的新蛋白质,命名为AXIN1-295aa。

本文研究中,作者对五对GC样本进行高通量测序,差异表达的circAXIN1被提示编码一种新的蛋白质。CircAXIN1编码一种新的蛋白质AXIN1-295aa。如图1所示,作者分别使用在过表达载体中插入Flag标签以及插入EMCV IRES序列的Luc2报告载体两种方式,验证了circAXIN1的翻译。(T系列和R系列circRNA翻译验证载体由广州吉赛生物提供)。



图2. CircAXIN1编码AXIN1-295aa的验证



参考文献:

1.   Circ-MALAT1 Functions as Both an mRNA Translation Brake and a microRNA Sponge to Promote Self-Renewal of Hepatocellular Cancer Stem Cells. Adv Sci (Weinh), 2020. 7(4): p. 1900949.

2. A novel protein AXIN1-295aa encoded by circAXIN1 activates the Wnt/β-catenin signaling pathway to promote gastric cancer progression. Mol Cancer .2021 Dec 4;20(1):158.

过表达载体构建及鉴定

以PCR扩增hsa_circ_00AAAA IRES全长***bp序列,以BamHI,EcoRI双酶切连接到Luc2-IRES-Report中。


图1   Luc2-IRES-Report载体图谱


载体测序引物:Luc-seqF: CAGGAGGACGCTCCAGATGA

测序峰图正常,无杂峰或叠带,序列对比吻合,表明IRES目的序列成功插入Luc2-IRES-Report中,载体构建成功。










R系列载体活性检测原理简介:

    报告载体质粒转染细胞,检测 F-Luc和R-Luc活性,以F-Luc/R-Luc的值判断序列的IRES活性。


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