产品简介
CRISPR/Cas13是继CRISPR/Cas9之后新发现的一类核酸酶系统，与Cas9靶向DNA不同，Cas13可以特异靶向RNA，实现对RNA的敲低、定点编辑、剪切调控和检测清除等。现已发现LwaCas13a、PspCas13b、PguCas13b、RanCas13b、EsCas13d、AdmCas13d、CasRx（RfxCas13d）等多个Cas13核酸酶，都可以靶向切割RNA，其中CasRx（RfxCas13d）具有最高的特异性和切割效率，也是目前发现最小的VI型CRISPR效应蛋白，能更容易利用AAV载体实现体内递送。
图1 CRISPR/CasRx系统敲低RNA示意图
CasRx靶向切割RNA时，靶标RNA的两端无需PFS，因此gRNA的设计更灵活，基本可靶向RNA的任意位置。与shRNA/CRISPRi等基因沉默技术相比，CRISPR/CasRx显示有更高的靶向特异性和敲低效率，以及最低的脱靶效应，表明其作为基因敲低工具的独特优势。
CasRx与核定位信号NLS融合表达时主要定位于细胞核，能更高效敲低mRNA及在细胞核内的其他RNA。
图2 CasRx (HA)的亚细胞定位（Konermann et al., 2018）
将gRNA设计为靶向环形RNA（circRNA）的反向剪切位点（back-splicing junction, BSJ）处时，CasRx能高效区分circRNA和其亲本基因mRNA，特异靶向敲低circRNA，而不影响mRNA。相比于siRNA/shRNA敲低circRNA时容易出现的效率低、脱靶或错误靶向mRNA，使用CRISPR/CasRx系统敲低circRNA是一个强有力的选择和补充工具。
图3 gRNA设计位置与circRNA/mRNA丰度（Li et al., 2020）。gRNA设计靶
向BSJ时，circRNA（红色）的丰度最低，而mRNA（蓝色）的丰度基本不变。
KDHPTM CRISPR/CasRx载体试剂盒提供多种整合型载体，将CasRx和crRNA在同一个载体中表达，只需要设计合成gRNA序列并连接插入即可，载体构建和转染方便。试剂盒包含整合型通用NC载体，以及构建目标载体的配套试剂，无需酶切，通过一步反应即可快速构建CasRx/gRNA载体。
表1 四种载体区别及对应试剂盒货号
货号
| 载体名称
| 载体骨架
| U6-gRNA
| CMV-CasRx
| NLS
| GFP
|
C0101-RL
| pCasRx-L1
| 慢病毒载体
| 有，NC
| 有
| 无
| 有
|
C0101-RNL
| pCasRxN-L1
| 慢病毒载体
| 有，NC
| 有
| 有
| 有
|
C0101-RA
| pCasRx-A1
| AAV载体
| 有，NC
| 有
| 无
| 无
|
C0101-RNA
| pCasRxN-A1
| AAV载体
| 有，NC
| 有
| 有
| 无
|
注：整合型载体为通用NC载体，含有non-targeting gRNA: TCACCAGAAGCGTACCATACTC。
产品特点
简便：单一整合型载体同时表达CasRx和crRNA，仅需合成gRNA双链，一步反应即可构建。
快速：30分钟即可完成载体连接。
高效：连接克隆阳性率达95%以上。
运输与保存
4℃运输，-20℃保存，保质期一年，避免反复冻融。
产品组分
货号
| 规格
| 试剂组分
|
C0101-RL
| 20 rxns
| Linearized CasRx Vector, From pCasRx-L1*
DNA Ligase Mix
10X Ligase Buffer
Nuclease-free Water
U6 Primer (10 μM)
gRNA-NC Vector, pCasRx-L1**
| 40 μL
10 μL
20 μL
200 μL
100 μL
2 μg
|
C0101-RNL
| 20 rxns
| Linearized CasRx Vector, From pCasRxN-L1*
DNA Ligase Mix
10X Ligase Buffer
Nuclease-free Water
U6 Primer (10 μM)
gRNA-NC Vector, pCasRxN-L1**
| 40 μL
10 μL
20 μL
200 μL
100 μL
2 μg
|
C0101-RA
| 20 rxns
| Linearized CasRx Vector, From pCasRx-A1*
DNA Ligase Mix
10X Ligase Buffer
Nuclease-free Water
U6 Primer (10 μM)
gRNA-NC Vector, pCasRx-A1**
| 40 μL
10 μL
20 μL
200 μL
100 μL
2 μg
|
C0101-RNA
| 20 rxns
| Linearized CasRx Vector, From pCasRxN-A1*
DNA Ligase Mix
10X Ligase Buffer
Nuclease-free Water
U6 Primer (10 μM)
gRNA-NC Vector, pCasRxN-A1**
| 40 μL
10 μL
20 μL
200 μL
100 μL
2 μg
|
*: Linearized CasRx Vector为对应载体去除non-targeting gRNA序列的开环载体，末端保留连接定位序列。
**: gRNA-NC Vector为含有non-targeting gRNA的通用NC载体，与Linearized CasRx Vector为同一骨架。
实验流程
图4 CRISPR/CasRx Knockdown Cloning Kit实验流程图
