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T7转录试剂盒 | GS™ T7 Biotin Labeled RNA Synthesis Kit
来源: | 作者:geneseed | 发布时间: 2021-09-18 | 613 次浏览 | 分享到:

产品简介

本试剂盒利用重组T7 RNA聚合酶,以Biotin-NTP Mix为底物,在体外快速高效合成含生物素标记的RNA。合成的生物素标记RNA可用于RNA Pull-down、Northern Blot、原位杂交等实验。使用1 μg DNA模板时,每次反应中RNA生成量不低于50 μg。


产品组分

组分

R0402 (3 rxns) *

T7 RNA Polymerase Mix

4.75 μL

T7 Reaction Buffer

4.75 μL

Biotin-NTP Mix **

20 μL

RNase-Free DNase I (1 U/μL)

6.3 μL

10× DNase Reaction Buffer

30 μL

RNase-Free Water

300 μL

*:使用20 μL体系时,本试剂盒可进行3次转录反应。

**:Biotin-NTP Mix内含ATP, GTP, CTP, UTP和Biotin-16-UTP,其中UTP与Biotin-16-UTP的比例为2:1。


保存条件

低温运输,-20℃保存,保质期12个月。


自备材料

1. RNA纯化回收:TRIzol LS Reagent、磁珠或过柱纯化试剂盒。

2. RNA检测:微量分光光度计、Qubit荧光计、琼脂糖凝胶电泳设备或Agilent 2100等。

3. 其他试剂与耗材:RNase-Free或DEPC处理的PCR管和吸头等。


操作流程

  1.  DNA模板制备

使用含有T7启动子序列的线性化质粒、PCR产物或合成的寡核苷酸为模板,模板应保证高纯度高质量,避免RNase、蛋白质、RNA或盐类污染。

以线性化质粒为模板的,应使质粒线性化形成平末端或5’突出末端,线性化后应进行琼脂糖凝胶电泳检测,确保线性化切割完全,并纯化回收。在20 μL反应体系中,线性化质粒模板可使用0.5~1 μg。

以PCR产物为模板的,可在引物上加入T7启动子序列进行PCR扩增,确保T7启动子序列的方向正确。PCR产物应进行琼脂糖凝胶电泳检测,确保条带单一且大小正确,并纯化回收。在20 μL反应体系中,PCR产物模板可使用0.2~0.75 μg。


2. RNA转录合成

1) 从试剂盒中取出各组分试剂,冰上融化颠倒混匀,短暂离心后置于冰盒上备用。

2) 按照下表依次添加试剂,配置反应体系。

表1  RNA转录合成的反应体系

组分

用量

RNase-Free Water

Up to 20 μL

T7 Reaction Buffer

1.5 μL

Biotin-NTP Mix

6.5 μL

DNA模板

X μL

(线性化质粒0.5~1 μg,PCR产物0.2~0.75 μg)

T7 RNA Polymerase Mix

1.5 μL

3) 颠倒混匀并短暂离心,置于PCR仪上37℃孵育2 h。合成小于300 nt的短链RNA时应37℃孵育4~16 h。


3. DNA模板去除

向反应液中依次添加68 μL RNase-Free Water,10 μL 10× DNase Reaction Buffer,和2 μL RNase-Free DNase I (1 U/μL),置于PCR仪上37℃孵育15 min

      

      4.纯化回收

  使用TRIzol LS Reagent、磁珠或RNA柱纯化试剂盒,纯化回收生物素标记的RNA。

      

       5.RNA检测

1) 定量检测

使用微量分光光度计(如Nanodrop)或Qubit荧光计检测RNA的浓度和纯度。


2) 电泳检测

使用琼脂糖凝胶电泳或Agilent 2100检测RNA的大小和完整性,生物素标记的RNA分子量增大,条带大小可能比预期偏大。使用非变性琼脂糖凝胶电泳时,可以先将RNA置于65℃孵育10 min,再上样检测。



产品说明书


吉赛生物T7转录试剂盒说明书.pdf