产品简介
本试剂盒利用重组T7 RNA聚合酶，以Biotin-NTP Mix为底物，在体外快速高效合成含生物素标记的RNA。合成的生物素标记RNA可用于RNA Pull-down、Northern Blot、原位杂交等实验。使用1 μg DNA模板时，每次反应中RNA生成量不低于50 μg。
产品组分
组分 | R0402 (3 rxns) * |
T7 RNA Polymerase Mix | 4.75 μL |
T7 Reaction Buffer | 4.75 μL |
Biotin-NTP Mix ** | 20 μL |
RNase-Free DNase I (1 U/μL) | 6.3 μL |
10× DNase Reaction Buffer | 30 μL |
RNase-Free Water | 300 μL |
*：使用20 μL体系时，本试剂盒可进行3次转录反应。
**：Biotin-NTP Mix内含ATP, GTP, CTP, UTP和Biotin-16-UTP，其中UTP与Biotin-16-UTP的比例为2:1。
保存条件
低温运输，-20℃保存，保质期12个月。
自备材料
1. RNA纯化回收：TRIzol LS Reagent、磁珠或过柱纯化试剂盒。
2. RNA检测：微量分光光度计、Qubit荧光计、琼脂糖凝胶电泳设备或Agilent 2100等。
3. 其他试剂与耗材：RNase-Free或DEPC处理的PCR管和吸头等。
操作流程
DNA模板制备
使用含有T7启动子序列的线性化质粒、PCR产物或合成的寡核苷酸为模板，模板应保证高纯度高质量，避免RNase、蛋白质、RNA或盐类污染。
以线性化质粒为模板的，应使质粒线性化形成平末端或5’突出末端，线性化后应进行琼脂糖凝胶电泳检测，确保线性化切割完全，并纯化回收。在20 μL反应体系中，线性化质粒模板可使用0.5~1 μg。
以PCR产物为模板的，可在引物上加入T7启动子序列进行PCR扩增，确保T7启动子序列的方向正确。PCR产物应进行琼脂糖凝胶电泳检测，确保条带单一且大小正确，并纯化回收。在20 μL反应体系中，PCR产物模板可使用0.2~0.75 μg。
2. RNA转录合成
1) 从试剂盒中取出各组分试剂，冰上融化颠倒混匀，短暂离心后置于冰盒上备用。
2) 按照下表依次添加试剂，配置反应体系。
表1 RNA转录合成的反应体系
组分 | 用量 |
RNase-Free Water | Up to 20 μL |
T7 Reaction Buffer | 1.5 μL |
Biotin-NTP Mix | 6.5 μL |
DNA模板 | X μL (线性化质粒0.5~1 μg，PCR产物0.2~0.75 μg) |
T7 RNA Polymerase Mix | 1.5 μL |
3) 颠倒混匀并短暂离心，置于PCR仪上37℃孵育2 h。合成小于300 nt的短链RNA时应37℃孵育4~16 h。
3. DNA模板去除
向反应液中依次添加68 μL RNase-Free Water，10 μL 10× DNase Reaction Buffer，和2 μL RNase-Free DNase I (1 U/μL)，置于PCR仪上37℃孵育15 min。
4．纯化回收
使用TRIzol LS Reagent、磁珠或RNA柱纯化试剂盒，纯化回收生物素标记的RNA。
5．RNA检测
1) 定量检测
使用微量分光光度计（如Nanodrop）或Qubit荧光计检测RNA的浓度和纯度。
2) 电泳检测
使用琼脂糖凝胶电泳或Agilent 2100检测RNA的大小和完整性，生物素标记的RNA分子量增大，条带大小可能比预期偏大。使用非变性琼脂糖凝胶电泳时，可以先将RNA置于65℃孵育10 min，再上样检测。