引言
目前，circRNA的研究主要是基于二代测序平台。虽然二代测序可以同时对数百万个短序列读长进行测序，但是无法完整的捕获circRNA全长以及难以准确地对circRNA进行定量。随着circRNA研究的不断深入，circRNA全长序列的鉴定和分析变得越来越重要。但如何才能分析和得到circRNA的全长序列呢？有没有新的策略能直接实现这个目标？
答案是肯定的。“君子生非异也，善假于物也。”这句话也很适合于纳米孔测序技术。凭借其长读长的优势（就怕你不够长）完爆二代测序短读长的特点。吉赛生物最新推出的circRNA测序服务——基于纳米孔测序的circRNA全长鉴定和定量，就是此“物”，旨在探寻“君子”之芳容。
如何探寻？
利用随机引物对富集后的circRNA进行滾环反转录扩增，使用纳米孔测序技术对circRNA的全长序列进行直接测序，并通过特定算法实现circRNA 表达定量和变异转录本全长序列的识别。
实验室原理图
生信分析内容及流程图
“芳容”如何？
1.测序文库大小
我们都知道，测序文库的大小在某种程度上会对 circRNA 分子的检出率以及定量造成影响，因此可通过特定算法的校正，选择最佳的检测长度，从而使circRNA分子的检出率达到最佳，完整捕获circRNA分子，无须像二代测序那样用算法去拼接。
图1. 纳米孔测序文库长度与数据量直方图
2、circRNA检出率
图2. Nanopore与Illumina测序 circRNA 丰度比较。多物种以及多种生理状态显示，Nanopore的 circRNA 有效检出率远高于Illumina测序。
3、可变剪切事件
图3. Nanopore 全长鉴定 circRNA 隐藏且复杂的转录及可变剪切图谱
图4. mmu-circMsrb3_0004 在小鼠心脏/脑中的表达水平
小鼠基因 Msrb3 只包含 3 个线性转录本，却能够转录至少 10 个环状转录本分子（如图3）。
Nanopore 全长技术鉴定出的 circRNAs 多种多样，包括
• exonic circRNAs
• EIciRNAs
• intronic circRNAs
相比 Illumina 仅仅检测 BSJ，Nanopore 全长鉴定能够观察到 circRNA 真实的内部构造，甚至发现新的 circRNA 外显子（如图3中红色框）。
特别地， Nanopore 以及 NGS 都检测到 mmu-circMsrb3_0004 在小鼠心脏/脑中有较高的表达（如图4），Nanopore 全长鉴定更是识别到该环状分子的 3 个 isoforms。
4、GO/Pathway富集分析（Nanopore sequencing）
a
b
c
图5. 癌症/癌旁差异分析及功能富集分析表明差异circRNA 参与神经相关功能与通路
欣赏了circRNA的 “芳容”，我们可以发现纳米孔测序技术在检测circRNA上的优势：
更强的检出率
相比二代测序，纳米孔测序可以将circRNA reads检测效率提高20倍以上
更高的灵敏度
可识别低丰度的circRNA，能够更敏感地捕获到非经典circRNA，i.e. intronic
准确识别可变剪切事件（特有）
纳米孔测序能够完整地捕获RNA分子，无须拼接，可识别 circRNA 隐藏的复杂结构
我们都知道，circRNA在总RNA中的比例是非常低的，并且受到组织类型与组织状态等的影响。但是在纳米孔测序技术中，我们仅需要1 μg的total RNA起始量即可完成纳米孔的建库与测序（circRNA二代测序至少也需要2 μg的起始量）。所以纳米孔测序技术在circRNA的全长鉴定和定量中是大有作为的。我们在前面的文章也有做过相关文章的解读：
circRNA研究新策略 | 三代测序是否能引领circRNA走向未来
吉赛生物在基于纳米孔测序的circRNA全长鉴定和定量的研究服务中已具有丰富的经验，形成了一套完整的解决方案。欢迎大家垂询！