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如何通过序列设计与优化，为circRNA药物开发降本增效？
circRNA药物开发涵盖序列设计、合成与包封、概念验证、工艺开发、质量研究、放大生产、临床前药效/安全性评价及临床试验等环节。其中，设计优化circRNA（线性前体RNA）序列，提升环化与翻译效率，是确保工程化circRNA作为治疗平台优越性和可行性的关键前提。
/ 提高环化效率以降低成本 /
节省原料：以更少的原料，得到更多circRNA；
降低纯化难度：减少线性RNA或副产物，避免杂质影响产品活性和免疫原性。
提升产量与规模：有利于放大生产，实现大规模工业化生产。
加速研发与生产：提高circRNA的合成效率，缩短研发和生产周期。
/ 如何突破环化效率瓶颈？ /
环化策略优化
传统PIE环化策略
PIE（permuted intron-exon）环化法基于I型内含子自剪接，反应条件简单，可合成长序列circRNA，是目前应用最广泛的环化策略。
劣势：
● T4噬菌体Td基因来源的I型内含子反应效率较低；
● 环化后残留外源外显子序列，干扰circRNA功能且可能引起先天性免疫反应。
升级PIE环化策略
吉赛生物circPrecise®环化策略（获中美专利授权），基于鱼腥藻I型内含子自剪接酶，该策略通过模拟线性RNA前体的二级结构，设计环化位点，并用目标RNA序列替换自剪接酶的外显子，实现高效精准的环化。
优势：
● 环化效率高：鱼腥藻pre-tRNA来源的I型内含子自剪酶效率更高；
● 序列精准：无外源外显子插入，保障circRNA安全性与有效性；
● 序列长度无限制：可满足不同长度和复杂度序列的精准高效环化。
此外，适当匹配同源臂，拉近剪接位点，可提高剪接酶可及性和效率；加入间隔序列，分隔高度结构化的IRES和剪接酶内含子，确保元件可独自折叠并正常发挥功能，可保障顺利环化。
图1 吉赛生物circPrecise®环化策略
传统T4连接酶2环化策略
T4连接酶2对双链RNA的连接效率远高于单链RNA。传统方法通过引入寡核苷酸辅助夹板，与环化位点附近形成双链结构，以提升环化效率。
劣势：夹板的引入，增加纯化难度，且长片段RNA环化效率仍较低。
升级T4连接酶2环化策略
吉赛生物基于T4连接酶2的专利环化策略circPure®（获国家发明专利授权），通过模拟RNA的二级结构，设计环化位点，使环化位点附近配对适量碱基对，然后进行T4连接酶2反应。
优势：无需添加辅助夹板，即可显著提升T4连接酶2的反应效率，高效完成环化。
图2 吉赛生物circPure®环化策略
环化位点设计
配合不同的RNA环化策略，
吉赛生物针对随机环化位点，构建了体外分子进化和高通量文库筛选模型，成功筛选并验证出实现高效精准环化的最佳特征序列。
优势：基于特征序列，可快速精准定位最佳环化位点，显著提升不同序列RNA的环化效率和成功率。
/ 提升翻译效率以增强药物疗效 /
减少剂量：产生更多治疗性蛋白/肽，降低达到治疗效果所需的剂量。
降低成本：减少生产所需circRNA量，直接降低药物成本。
拓展应用：满足高水平蛋白需求的靶点，拓宽治疗应用领域。
竞争优势：增强药物疗效，使circRNA药物临床应用优势更显著。
/ 如何使环状RNA翻译“提速”？ /
高活性IRES选择
工程化circRNA利用内部翻译起始元件IRES驱动翻译。选择高活性的IRES，如同为circRNA翻译装上“高效引擎”。
吉赛生物特色服务
● 建立的高活性IRES库，含有大量经筛选验证的高活性IRES，能匹配大部分circRNA翻译的需求。
● 依托翻译组测序平台，提供高通量IRES筛选与验证服务，满足个性化IRES筛选需求，如驱动组织/细胞特异性翻译的IRES。核心技术包括：
Nanopore RNC-seq：高通量分析不同IRES的翻译活性，筛选高活性IRES；
Ribo-seq：验证特定IRES的翻译效率，确保结果精准可靠。
图3 基于RNC-seq技术，高通量筛选TOP 50高活性的IRES序列。
UTR调控元件匹配
mRNA的UTR中特定序列元件可显著提升翻译效率。如5' UTR的Kozak序列可以增强真核生物起始密码子识别，3' UTR的富含AU序列也可以促进mRNA翻译。这些元件与匹配的IRES协同作用，可进一步增强circRNA的翻译效率。
ORF优化
密码子优化
基于密码子的简并性和偏好性，对ORF进行密码子优化可显著提升翻译效率并保障准确性。优化策略包括：
● 调整密码子适应指数（CAI）和tRNA适应指数（tAI）：优先选用偏好密码子，避免稀有密码子；
● 优化密码子重复率和氨基酸重复率，避免密码子短缺；
● 优化RNA二级结构，增强稳定性，保障翻译延伸；
● 增加提升翻译效率的特定motif，减少抑制翻译的motif；
● 调整GC含量，提高circRNA稳定性和翻译效率。
ORF与IRES互作优化
通过CAI、折叠最小自由能（MFE）、二级结构等多维度参数，综合分析ORF与IRES的相互作用，可精准筛选最佳翻译元件组合。
吉赛生物服务特色
依托翻译组测序平台，提供高通量ORF筛选与验证服务，为高翻译活性和表达水平的序列的筛选提供参考，核心技术包括：
Ribo-seq：高通量分析circRNA翻译的核糖体足迹密度及丰度，分析全序列的翻译状态；
Polysome profiling：精准评估优化序列的全局翻译效率；
WB、ELISA、报告基因系统等：验证蛋白的表达量。
图4 ORF优化后，验证circRNA翻译活性及表达水平。A：基于Ribo-seq技术得到显示核糖体足迹的环形柱状图，表明密码子优化后，核糖体密度与峰度均有明显提高；B：经过序列优化的circRNA在细胞中表达的荧光强度明显高于未优化序列，表明优化后蛋白表达水平更高。
