circRNA是由前体RNA通过反向剪接（back-splicing）形成的，无5'-端帽子和3'-端poly (A)尾巴的共价闭环单链RNA。大量研究证明circRNA在病理和生理过程中起重要作用，circRNA具有作为生物标记物、治疗靶点和新药物的潜力。此外，circRNA因独特的闭环结构而稳定性更强，作为线性mRNA的有效替代品，是下一代RNA疗法开发的理想平台。因此，circRNA在癌症等多种疾病中的研究备受关注。

吉赛生物是引领circRNA科学研究与应用转化的先行者，聚焦circRNA细分领域十余年，依托强大的原研开发能力，建立合成生物学、分子生物学、测序及生信等多个技术平台，可为广大科研人员提供全流程的circRNA研究解决方案。

 ① RNA-seq或circRNA-seq（Nanopore circRNA全长测序）分析目标样本，筛选特定表型或疾病中表达有明显差异的circRNA；

 ② 联合数据库生信分析结果，得到有潜在研究价值候选circRNA。

图1 circRNA-seq得到热图和散点图结果显示宫颈癌（CC）组织中存在数百个circRNA表达差异[1]

③ 针对编码circRNA的研究，可联合翻译组测序Ribo-seq或RNC-seq及生信分析，挖掘潜在可翻译的RNA，并预测IRES元件和ORF序列。

图2 ribo-seq分析人类心脏循环的可翻译circRNA。[2]

图3 RNA-seq联合RNC-seq筛选胶质瘤细胞中差异表达的可翻译circRNA。[3]

相关技术服务：

转录组测序：Nanopore circRNA全长测序、circRNA-seq、RNA-seq

翻译组测序：Ribo-seq、RNC-seq

生物信息学：生物医学大数据挖掘分析、circRNA定制化分析及绘图、常规组学及多组学联合分析、单细胞测序数据生信分析

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提取与纯化：总RNA提取试剂（Trizol）、液体样品总RNA提取试剂（Trizol LS）、外泌体提取试剂盒

测序建库：Taqman探针法支原体检测试剂盒(UNG防污染版)、RNA-seq文库构建试剂盒、核糖体RNA去除试剂盒 (人/大鼠/小鼠)(植物)

① 内源丰度：qRT-PCR验证候选circRNA在目标样品中的内源丰度。筛选对比样品中表达量有明显差异，且内源丰度合适的circRNA进行下一步验证。

图4 qRT-PCR结果显示，circCCDC134在24个肿瘤组织和10个转移组织和CC细胞中过表达[1]

② 环状结构：设计circRNA引物进行PCR和Sanger测序，结合RNase R耐受实验鉴定候选分子的环状RNA结构。

图5 鉴定circCORO1C环状结构。

B：RT-PCR和Sanger测序验证circCORO1C的反向剪接连接；

E：RNase R处理和RT-PCR分析验证FD-LSC-1和TU-177细胞中circCORO1C的稳定性。[4]

③ 作用定位：荧光原位杂交（FISH）实验分析候选circRNA主要富集于细胞核还是细胞质。

    不同定位的circRNA的功能和机制类型可能不同，还会影响后续的基因敲低策略的选择。

图6 用Cy3标记的circSPON2探针(红色)进行FISH检测，显示circSPON2在PC-3细胞质中富集。[5]

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表达量分析：引物合成及验证

结构鉴定：circRNA成环验证和全长鉴定 、RNase R耐受实验 

定位分析：荧光原位杂交（FISH）

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提取与纯化：总RNA提取试剂（Trizol）、液体样品总RNA提取试剂（Trizol LS）

表达量分析：qRT-PCR试剂盒

结构鉴定：RNase R

定位分析：原位杂交试剂盒

① 在目标细胞中过表达或敲低候选circRNA。

    过表达的方式：转染体外制备的circRNA、瞬转circRNA质粒、利用病毒载体构建circRNA过表达的稳转细胞株等。

    敲低的方式：转染siRNA、ASO、瞬转shRNA载体、利用病毒载体构建circRNA敲低的稳转细胞株等。

    敲低细胞质富集的circRNA可用siRNA和shRNA，敲低细胞核富集的circRNA可用ASO。

图7 qRT-PCR分析circSTX6敲低和过表达PANC-1和CFPAC-1细胞中circSTX6和线性STX6的表达。[6]

② 检测细胞增殖、周期、凋亡、迁移和侵袭，体外验证circRNA的功能。

     候选circRNA可影响细胞功能，则可进一步研究作用机制；对细胞功能无影响，则考虑重新筛选circRNA。

图8 通过EdU、CCK8、Transwell等细胞实验验证circSTX6的功能。[6]

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过表达/敲低：circRNA体外合成-LNP包封、circRNA过表达/敲低载体构建及验证、慢病毒（LV）/腺相关病毒（AAV）包装、稳株构建、siRNA/ASO设计、合成及验证

细胞功能验证：细胞功能实验

细胞质定位的circRNA可能通过ceRNA、与蛋白互作、编码蛋白等机制发挥作用；而细胞核定位的circRNA可能通过与DNA或转录因子互作调控转录。

图9 circRNA功能的一般机制[7]

（1）ceRNA（competing endogenous RNAs,内源竞争RNA）机制

miRNA可通过结合mRNA导致基因沉默，而部分circRNA可作为miRNA sponge竞争性结合miRNA，从而调控基因表达。

miRNA基因沉默过程中涉及的AGO2是将miRNA加工为成熟的沉默合体（miRISC）的关键蛋白。

① 验证circRNA与miRISC互作

·用anti-AGO2抗体进行RIP-qPCR实验，检测AGO2与circRNA的结合；

·通过标签法体内RNA pulldown实验，Western Blot检测pulldown产物中的AGO2，miRNA-seq分析产物中的miRNA。

图10 采用AGO2和IgG抗体进行RIP检测SW620细胞中AGO2与circHAS2的互作。[8]

② 验证circRNA与miRNA互作

·联合miRNA-seq和circBank等数据库预测circRNA互作的候选miRNA；

·FISH共定位及双荧光素酶实验验证miRNA与circRNA的结合；

·转染miRNA mimic或inhibitor到细胞中，验证miRNA的细胞功能。

图11 双荧光素酶实验研究circEYA3与miR-1294互作。[9]

③ 研究miRNA的靶mRNA

·mRNA-seq和生信分析预测miRNA的靶mRNA；

·转染miRNA mimic或inhibitor到细胞中，验证mRNA的表达量变化；

·双荧光素酶实验验证miRNA和mRNA的结合。

图12 A：利用数据库预测miR-1294的靶基因；B-C：转染miR-1294 mimic或inhibitor，qRT-PCR检测c-Myc和SURF4的表达；D-F：双荧光素酶实验验证miR-1294与c-Myc互作。[9]

④ 体外机制验证

·进行挽救实验，体外验证circRNA-miRNA-mRNA的相互作用机制。

（2）与蛋白互作影响蛋白功能

circRNA可作为支架，或蛋白sponge，调节蛋白之间的互作或蛋白的功能。

① circRNA pulldown联合LC-MS/MS和Western Blot定性或定量分析circRNA互作的蛋白。

图13 探针法circRNA pulldown联合LC-MS/MS和Western Blot分析circCDK13互作的蛋白。[10]

②利用互作蛋白特异性抗体进行RIP-qPCR反向验证蛋白与circRNA的互作。

图14 RIP验证circCDK13与IGF2BP3之间的相互作用。[11]

③ 免疫荧光结合荧光原位杂交（IF-FISH）可检测circRNA和目标蛋白细胞或组织中的互作情况。

图15 IF-FISH检测显示circACTN4与FUBP1在乳腺癌细胞核中共定位。[11]

④ Co-IP实验可研究circRNA是否影响蛋白之间相互作用。

⑤ 通过细胞实验体外验证circRNA-蛋白互作机制。

（3）编码蛋白

circRNA曾被认为是“非编码RNA”，后来陆续有研究证明circRNA可以编码多肽或蛋白，并发挥特定的功能。

①验证编码能力

·Ribo-seq或RNC-seq联合生信分析可预测有翻译或编码可能性的circRNA及其ORF和IRES元件；

·构建T系列载体，可进一步验证circRNA的翻译能力。

图16 构建T系列载体，验证circCAPG的编码潜能。[12]

② 翻译产物结构分析

通过标签抗体或制备特异性抗体IP/Co-IP下拉翻译产物，采用灵敏且快速扫描的LC-MS/MS结合Western Blot分技术，定性或定量分析翻译的产物。

图17 利用 FLAG抗体进行IP，质谱检测circCAPG-FLAG中CAPG-171aa，并分析其氨基酸序列。[12]

③ 翻译机制

典型IRES元件介导：构建R系列载体，可验证目的circRNA翻译是否为典型IRES元件介导，并验证IRES元件的活性。

图18 构建R系列载体，验证circCAPG的IRES活性。[13]

m6A甲基化修饰介导：MeRIP实验可分析目的circRNA是否存在m6A甲基化修饰。

图19 根据MeRIP-seq结果研究m6A介导circRNA翻译。[14]

④ 翻译产物功能验证

通过构建circRNA过表达、翻译产物过表达载体及相关突变载体，转染细胞进行细胞实验验证circRNA或翻译产物的功能。

（4）调控转录

① circRNA pulldown-LC-MS/MS结合RIP可分析circRNA与转录相关蛋白的相互作用；

② 利用转录因子抗体进行ChIP-seq，结合数据库预测结果可筛选调控转录的靶基因；

③ 通过挽救实验可进一步验证circRNA-转录相关蛋白-靶基因DNA之间的相互调控作用。

图20 CircACTN4招募YBX1共同激活FZD7转录。A-C：利用ChIP-seq对FRH0201细胞中YBX1结合区域的全基因组分布进行分析；D：联合RNA-seq和ChIP-seq结果得到靶基因FZD7和LRP1；E：ChIP-qPCR检测FRH0201细胞中FZD7启动子TSS - 1200 ~ - 800 bp区域YBX1富集增加。[15]

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机制研究：RIP-qPCR/RIP-seq、RNA pulldown-WB/LC-MS/MS、miRNA-seq、荧光素酶报告检测、mimic/inhibitor、FISH/IF-FISH检测、Co-IP、MeRIP-seq、ChIP-seq

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• 分子互作：RNA pull-down试剂盒、RIP试剂盒

建立动物模型，利用体外制备的LNP-circRNA或病毒载体给药处理，验证circRNA在体内的功能，对生理或病理的调控作用。

图21 动物模型验证CircSTX6在体内的作用。[6]

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过表达/敲低：circRNA体外合成-LNP包封、circRNA过表达/干扰载体构建及验证、慢病毒（LV）/腺相关病毒（AAV）包装、稳株构建

案例文献：

[1] Liang L et al. ALKBH5-mediated m6A modification of circCCDC134 facilitates cervical cancer metastasis by enhancing HIF1A transcription. J Exp Clin Cancer Res. 2022, 41(1):261.

[2] van Heesch S et al. The Translational Landscape of the Human Heart. Cell. 2019, 178(1):242-260.e29.

[3] Zhang M et al. A peptide encoded by circular form of LINC-PINT suppresses oncogenic transcriptional elongation in glioblastoma. Nat Commun. 2018 , 9(1):4475.

[4] Wu Y et al. Circular RNA circCORO1C promotes laryngeal squamous cell carcinoma progression by modulating the let-7c-5p/PBX3 axis. Mol Cancer. 2020, 19(1):99.

[5] Yao B et al. The circSPON2/miR-331-3p axis regulates PRMT5, an epigenetic regulator of CAMK2N1 transcription and prostate cancer progression. Mol Cancer. 2022, 21(1):119.

[6] Meng L et al. CircSTX6 promotes pancreatic ductal adenocarcinoma progression by sponging miR-449b-5p and interacting with CUL2. Mol Cancer. 2022, 21(1):121.

[7] Kristensen LS et al. The biogenesis, biology and characterization of circular RNAs. Nat Rev Genet. 2019, 20(11):675-691.

[8] Li H et al. CircHAS2 activates CCNE2 to promote cell proliferation and sensitizes the response of colorectal cancer to anlotinib. Mol Cancer. 2024, 23(1):59.

[9] Rong Z et al. Circular RNA CircEYA3 induces energy production to promote pancreatic ductal adenocarcinoma progression through the miR-1294/c-Myc axis. Mol Cancer. 2021, 20(1):106.

[10] Huang Q et al. circCDK13-loaded small extracellular vesicles accelerate healing in preclinical diabetic wound models. Nat Commun. 2024, 15(1):3904.

[11] Wang X et al. The circACTN4 interacts with FUBP1 to promote tumorigenesis and progression of breast cancer by regulating the expression of proto-oncogene MYC. Mol Cancer. 2021, 20(1):91.

[12] Song R, et al. A novel polypeptide CAPG-171aa encoded by circCAPG plays a critical role in triple-negative breast cancer. Mol Cancer. 2023, 22(1):104.

[13] Chen R, et al. CircTmeff1 Promotes Muscle Atrophy by Interacting with TDP-43 and Encoding A Novel TMEFF1-339aa Protein. Adv Sci (Weinh). 2023, 10(17):e2206732.

[14] Yang Y, et al. Extensive translation of circular RNAs driven by N6-methyladenosine. Cell Res. 2017, 27(5):626-641.

[15] Chen Q et al. Circular RNA ACTN4 promotes intrahepatic cholangiocarcinoma progression by recruiting YBX1 to initiate FZD7 transcription. J Hepatol. 2022, 76(1):135-147.