RNA pull-down试剂盒

RNA pull-down是检测RNA结合蛋白与RNA之间相互作用的主要实验手段之一。该技术利用体外合成生物素标记RNA模拟天然RNA分子，作为探针，与细胞裂解液孵育。探针与裂解液中的蛋白形成RNA-蛋白质复合物，可被链霉亲和素磁珠特异性结合捕获，从而实现RNA结合蛋白（RBPs）的捕获富集。

产品特点

1. 方便：试剂盒成分完整，包含pull-down实验整套试剂；

2. 快捷：2.5小时即可完成；

3. 稳定：捕获效率高，实验体系稳定，重复性高。

产品应用

● 靶RNA结合蛋白的验证或筛选；

● 适用长链、线性 RNA 探针（模拟靶 RNA 序列）直接拉取互作蛋白。

操作流程

结果展示

图1. AR+探针特异性捕获HuR蛋白

RNA pulldown 实验就是先将RNA进行生物素标记，再与细胞裂解液共同孵育，从而形成RNA-蛋白质复合物，之后再分离复合物得到蛋白质，通过WB或质谱检测蛋白质的技术。

我们知道，RIP是从蛋白出发研究蛋白RNA相互作用的技术，通过已知蛋白去验证可能有相互作用RNA分子；而RNA pull-down则是从RNA出发研究蛋白与RNA相互作用的技术，通过已知RNA去拉蛋白，推测可能与已知RNA结合的蛋白分子。所以RIP和RNA pull-down两种技术可以从正反双向进行验证，能更准确的反映RNA与蛋白的相互作用。

案例1

胃癌是全球第四大诊断类癌症，也是全球癌症相关死亡的第三大常见原因。由于胃癌进展的病理机制尚不完全清楚，因此需要更多的研究来发现和开发胃癌诊断和治疗的有效生物标志物和靶标。在本文中，作者发现并命名了一种新的lncRNA_GClnc1。它作为支架(Scaffold) lncRNA募集WDR5和KAT2A这两种蛋白质，并激活靶基因SOD2的转录，最终促进胃癌进展。

图1. GClnc1 RNA pull-down结果图

本文研究中，为了探索GClnc1促进胃癌的机制，作者使用了RNA pull-down分析来鉴定细胞内GClnc1结合因子（Fig-1A）。 GClnc1下拉样本中有两个特定的条带。作者鉴定了94和101种潜在的结合蛋白（Fig-1B）。Western印迹显示仅WDR5和KAT2A特异性结合GClnc1（Fig-1C）。数据表明这两种蛋白质可能形成复合物以与GClnc1相互作用。[1]

案例2

(A) 通过体外转录合成生物素标记的有义和反义 (阴性对照) MEG3 RNA。(B)体外RNA 下拉试验。HEK293T 细胞裂解物与生物素标记的寡核苷酸一起孵育。下拉后，对蛋白质进行 SDS-PAGE 并用考马斯亮蓝染色。对箭头指示的条带进行质谱分析。(C) 蛋白质印迹以确定有义MEG3 RNA 与 PTBP1 蛋白的特异性相互作用，但不与 PCNA 蛋白（阴性对照）。(D) PTBP1 与MEG3 RNA在体内相互作用的 RNA 免疫沉淀 (RIP)在 HEK293T 细胞中。使用 MEG3 或 Hprt1 的特异性引物（阴性对照）通过 RT-PCR 测定由抗 PTBP1 或 IgG 免疫沉淀的蛋白质-RNA 复合物。

该研究中，首先通过RNA Pulldown和后续质谱实验找到了与lncRNA MEG3结合的蛋白PTBP1，然后再通过PTBP1的抗体的RIP实验反向验证了lncRNA MEG3与PTBP1蛋白的结合。

案例解析参考文献：

[1] Tian-Tian Sun, Jie He, Qian Liang, Lin-Lin Ren, Ting-Ting Yan, Ta-Chung Yu, Jia-Yin Tang, Yu-Jie Bao, Ye Hu, Yanwei Lin, Danfeng Sun, Ying-Xuan Chen, Jie Hong, Haoyan Chen, Weiping Zou and Jing-Yuan Fang. LncRNA GClnc1 Promotes Gastric Carcinogenesis and May Act as a Modular Scaffold of WDR5 and KAT2A Complexes to Specify the Histone Modification Pattern. Cancer Dis. July 2016

[2] Long noncoding RNA MEG3 induces cholestatic liver injury by interaction withPTBP1 to facilitate shp mRNA decay.Hepatology 2017 02;65(2)

[1] IF8.469 Linc-ROR facilitates progression and angiogenesis of hepatocellular carcinoma by modulating DEPDC1 expression. Cell Death & Disease

[2] IF6.684 Inhibition of miR-185-3p Confers Erlotinib Resistance Through Upregulation of PFKL/MET in Lung Cancers. Frontiers in Cell and Developmental Biology

[3] IF6.244 circDNMT1 Promotes Malignant Progression of Gastric Cancer Through Targeting miR-576-3p/Hypoxia Inducible Factor-1 Alpha Axis. Frontiers in Oncology

[4] IF5.555 Long Noncoding RNA X-Inactive-Specific Transcript Promotes the Secretion of Inflammatory Cytokines in LPS Stimulated Astrocyte Cell Via Sponging miR-29c-3p and Regulating Nuclear Factor of Activated T cell 5 Expression. Frontiers in Endocrinology

[5] IF5.502 Silencing of LINC01963 enhances the chemosensitivity of prostate cancer cells to docetaxel by targeting the miR-216b-5p/TrkB axis. LABORATORY INVESTIGATION

[6] IF5.458 Increased LDL receptor by SREBP2 or SREBP2-induced lncRNA LDLR-AS promotes triglyceride accumulation in fish. iScience

[7] IF5.241 The lncRNA MIAT regulates CPT-1a mediated cardiac hypertrophy through m6A RNA methylation reading protein Ythdf2. Cell Death Discovery

[8] IF5.228 C/EBPα promotes porcine pre-adipocyte proliferation and differentiation via mediating MSTRG.12568.2/FOXO3 trans-activation for STYX. BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA-MOLECULAR AND CELL BIOLOGY OF LIPIDS

[9] IF4.599 CircDTL Functions as an Oncogene and Regulates Both Apoptosis and Ferroptosis in Non-small Cell Lung Cancer Cells. Frontiers in Genetics

[10] IF4.36 Circ_0001667 knockdown blocks cancer progression and attenuates adriamycin resistance by depleting NCOA3 via releasing miR-4458 in breast cancer. DRUG DEVELOPMENT RESEARCH

[11] IF3.575 Knockdown of circBFAR inhibits proliferation and glycolysis in gastric cancer by sponging miR-513a-3p/hexokinase 2 axis. BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS

[12] IF2.952 Circular RNA OMA1 regulates the progression of breast cancer via modulation of the miR‑1276/SIRT4 axis. Molecular Medicine Reports

[13] IF2.626 Regulation of circADAMTS6-miR-324-5p-PIK3R3 ceRNA pathway may be a novel mechanism of IL-1β-induced osteoarthritic chondrocytes. JOURNAL OF BONE AND MINERAL METABOLISM

[14] IF2.57 Long Non-Coding RNA GABPB1-AS1 Augments Malignancy of Glioma Cells by Sequestering MicroRNA-330 and Reinforcing the ZNF367/Cell Cycle Signaling Pathway. Neuropsychiatric Disease and Treatment

[15] IF2.192 Silencing of Circ_0135889 Restrains Proliferation and Tumorigenicity of Human Neuroblastoma Cells. JOURNAL OF SURGICAL RESEARCH

1、 这个pulldown试剂盒能做circRNA吗？

目前公司的RNA-Protein pulldown试剂盒适用于线性RNA，circRNA可以了解标签法，公众号解读“新一代circRNA pulldown 研究方法”有详细的介绍。

2、 pulldown产物是否能检测互作的RNA？用Trizol是否能抽提到RNA?

试剂盒体系中目前产物的分离体系主要是蛋白质，不涉及RNA提取及检测。

3、 目的探针是正义链探针还是反义链？

目的探针是正义链探针，阴性对照是其反义链。

4、 探针的建议用量是多少？

探针的使用量推荐50pmol/次，或根据实验具体情况调整用量。

5、 关于生物素标记探针

该试剂盒应用的生物素标记RNA探针，目的是模拟天然的RNA分子，理论上覆盖的序列越全越好，可通过直接合成或体外转录方式获取。但序列过长（大于2kb）则不易获得，可优先选择有预期蛋白结合的区域。

6、 怎么判断实验操作有没有问题？

建议在实验过程中设置阳性对照，试剂盒中是包含阳性对照探针和HuR抗体的；HuR蛋白几乎存在所有细胞样本中，且能够被阳性探针拉下，结合力较强。可以通过阳性对照HuR的WB结果判断实验操作是否有问题，阴性对照可选择性进行。

7、 pull down试剂盒中的loading buffer颜色很淡，和平时用的不一样，是否正常？

我司pulldown试剂盒的loading buffer 确实偏淡一些。主要考虑loading buffer过多会对核酸的跑胶结果有一定影响，因此能看到条带显示就足够了。

8、 RAP（RNA 反义纯化）与RNA-protein pulldown有哪些异同？

相同点：都是探针拉取RNA结合复合物。

不同点：

1）RAP本质是反义探针拉取靶基因及其结合其上的RNA、蛋白甚至DNA等复合物。而RNA-protein pulldown是靶基因正义序列探针钓取结合蛋白。

2）2）RAP本质是反义探针与靶基因RNA的核酸杂交，类似FISH，反应温度基本在37℃。而RNA-protein pulldown本质是长链核酸探针与蛋白之间的结合互作，反应温度在4℃。