Nanopore Direct RNA测序

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Nanopore直接RNA测序技术是对天然RNA进行测序，是对单个RNA分子进行单分子水平的全长测序，能够保留并检测RNA碱基修饰信息，对poly(A)尾长进行相对准确的估算，同时进行全长异构体分析，还原真实RNA特征。

Nanopore Direct RNA测序流程图（2019 Workman et al）

测序方案

测序模式：Nanopore Sequencing
测序数据量：6Gb/样，or 10Gb/样，or 15Gb/样

技术优势

1、Direct RNA技术无需PCR，无GC偏好性提供无偏全长且链特异的RNA序列；
2、Direct RNA技术准确检测poly(A)尾长度为分析RNA稳定性和翻译效率等转录后调控研究提供帮助；
3、Direct RNA技术直接识别RNA碱基修饰信号实现转录和表观信息的一举多得。
利用Nanopore测序技术对人类poly(A)转录组进行直接RNA测序
高通量cDNA测序使我们对转录组的复杂性和调控有了更深入的了解，但是该方法不能完全展现转录组的真实信息，其测序读长较短并且去除了天然RNA的碱基修饰信息。本研究利用Nanopore直接RNA测序技术从人类B淋巴细胞系GM12878分离并测序了原始poly(A) RNA，共生成约990万条通过质控的poly(A) RNA序列，读长N50约1,334bp。利用以上长读长数据，研究者首先检测和分析了转录异构体，在代表10,793个基因的33,984个异构体中，发现52.6%未经注释的剪接连接点，识别出了上千个目前在GENCODE v27中未经注释的基因，并发现了使用短读长测序则无法检测到的等位基因特异性异构体。例如：IFIH1基因，其父系同型保留了8号外显子，而母系同型则不保留8号外显子（图1）。

图1 ONT直接RNA测序转录本识别FIH1的等位基因特异性异构体的IGV视图。紫色方框指示等位基因特异性的SNP的位置（灰色为参考，红色和蓝色为SNPs），绿色方框指示可变剪接外显子。

随后结合短读长数据，研究团队直接测量了poly(A)尾长，分析发现了异构体间poly(A)尾的区别。采用ONT直接RNA测序对RNA结合蛋白DEAD-box解旋酶5（DDX5）的转录本poly(A)尾长度进行估计，内含子保留异构体的poly(A)尾长中值为327nt，而其蛋白编码异构体的poly(A)尾长中值为125nt（图2）。

图2 DDX5基因两种转录本异构体的poly(A)尾长分布及基因模型

最后，利用直接RNA测序数据中包含的RNA修饰信息，研究人员筛选了GENCODE敏感亚型的离子电流在GGACU模体(motif)上的改变，发现了86个基因(198个异构体) 的电流变化可以归因于异构体特异性m6A修饰。

图3 SNHG8基因异构体内GGACU motif的离子电流分布

研究人员表示基于短读长测序的RNA修饰分析去除了修饰之间以及修饰与其他RNA之间的特征，而Nanopore直接RNA测序则具备检测这些远程互作的能力。

参考文献
Workman R E, Tang A D, Tang P S, et al. Nanopore native RNA sequencing of a human poly (A) transcriptome[J]. Nature methods, 2019: 1-9.
生信分析

isoform分析
可变剪切分析
融合基因鉴定
PolyA分析

表达定量
转录本定量
转录本差异分析
富集分析
蛋白质互作网络

甲基化修饰分析
m⁶A位点注释
甲基化修饰富集分析
m⁶A差异分析

isoform联合定量表达分析
AltTP分析
功能多样性分析（FDA）
差异富集分析

新生mRNA分析
识别新生mRNA
新生mRNA半衰期分析
mRNA稳定相关性分析
新生mRNA差异分析

Table. Nanopore Direct RNA Sequencing样本送样建议

送样类型	送样量	完整性（RIN值）	浓度	纯度
Total RNA（组织、细胞、全血等）	≥50μg	≥8	≥180ng/μL	无DNA，蛋白/盐离子等污染，样本无色透明不粘稠
RNA带poly(A)尾	≥300ng	-	≥50ng/μL	无DNA，蛋白/盐离子等污染，样本无色透明不粘稠