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  • Nanopore Direct RNA测序

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    Nanopore直接RNA测序技术是对天然RNA进行测序,是对单个RNA分子进行单分子水平的全长测序,能够保留并检测RNA碱基修饰信息,对poly(A)尾长进行相对准确的估算,同时进行全长异构体分析,还原真实RNA特征。



    Nanopore Direct RNA测序流程图(2019 Workman et al



    测序方案


    测序模式:Nanopore Sequencing

    测序数据量:1Gb/样



    技术优势


    1、Direct RNA技术无需PCR,无GC偏好性提供无偏全长且链特异的RNA序列;

    2、Direct RNA技术准确检测poly(A)尾长度为分析RNA稳定性和翻译效率等转录后调控研究提供帮助;

    3、Direct RNA技术直接识别RNA碱基修饰信号实现转录和表观信息的一举多得。



  • 利用Nanopore测序技术对人类poly(A)转录组进行直接RNA测序

    高通量cDNA测序使我们对转录组的复杂性和调控有了更深入的了解,但是该方法不能完全展现转录组的真实信息,其测序读长较短并且去除了天然RNA的碱基修饰信息。本研究利用Nanopore直接RNA测序技术从人类B淋巴细胞系GM12878分离并测序了原始poly(A) RNA,共生成约990万条通过质控的poly(A) RNA序列,读长N50约1,334bp。利用以上长读长数据,研究者首先检测和分析了转录异构体,在代表10,793个基因的33,984个异构体中,发现52.6%未经注释的剪接连接点,识别出了上千个目前在GENCODE v27中未经注释的基因,并发现了使用短读长测序则无法检测到的等位基因特异性异构体。例如:IFIH1基因,其父系同型保留了8号外显子,而母系同型则不保留8号外显子(图1)。


     1 ONT直接RNA测序转录本识别FIH1的等位基因特异性异构体的IGV视图。紫色方框指示等位基因特异性的SNP的位置(灰色为参考,红色和蓝色为SNPs),绿色方框指示可变剪接外显子。



    随后结合短读长数据,研究团队直接测量了poly(A)尾长,分析发现了异构体间poly(A)尾的区别。采用ONT直接RNA测序对RNA结合蛋白DEAD-box解旋酶5(DDX5)的转录本poly(A)尾长度进行估计,内含子保留异构体的poly(A)尾长中值为327nt,而其蛋白编码异构体的poly(A)尾长中值为125nt(图2)。



    2 DDX5基因两种转录本异构体的poly(A)尾长分布及基因模型



    最后,利用直接RNA测序数据中包含的RNA修饰信息,研究人员筛选了GENCODE敏感亚型的离子电流在GGACU模体(motif)上的改变,发现了86个基因(198个异构体) 的电流变化可以归因于异构体特异性m6A修饰。


    3 SNHG8基因异构体内GGACU motif的离子电流分布


    研究人员表示基于短读长测序的RNA修饰分析去除了修饰之间以及修饰与其他RNA之间的特征,而Nanopore直接RNA测序则具备检测这些远程互作的能力。



    参考文献

    Workman R E, Tang A D, Tang P S, et al. Nanopore native RNA sequencing of a human poly (A) transcriptome[J]. Nature methods, 2019: 1-9.





  • 生信分析


    isoform分析

    可变剪切分析

    融合基因鉴定

    PolyA分析

     

    表达定量

    转录本定量

    转录本差异分析

    富集分析

    蛋白质互作网络

     

    甲基化修饰分析

    m6A位点注释

    甲基化修饰富集分析

    m6A差异分析

     

    isoform联合定量表达分析

    AltTP分析

    功能多样性分析(FDA)

    差异富集分析

     

    新生mRNA分析

    识别新生mRNA

    新生mRNA半衰期分析

    mRNA稳定相关性分析

    新生mRNA差异分析




  • Table. Nanopore Direct RNA Sequencing样本送样建议

    送样类型

    送样量

    完整性(RIN值)

    浓度

    纯度

    Total RNA(组织、细胞、全血等)

    ≥50μg

    ≥8

    ≥180ng/μL

    DNA,蛋白/盐离子等污染,样本无色透明不粘稠

    RNA带poly(A)尾

    ≥300ng

    -

    ≥50ng/μL

    DNA,蛋白/盐离子等污染,样本无色透明不粘稠


    *更具体的送样方法请详询销售或技术支持


    物种范围

    人、小鼠、大鼠等哺乳动物,植物等其他物种详询销售或技术支持




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