RIP

服务介绍

RNA免疫沉淀（RIP）利用针对目标蛋白质的抗体把相应的RNA-蛋白质复合物沉淀下来，经过分离纯化并对结合在复合物上的RNA进行测序或qPCR分析。RIP可应用于研究miRNA调节靶点、RNA与RBP（RNA结合蛋白）的互作关系等。

RIP技术原理

技术优势

1. 核酸和蛋白实验兼做，结果可靠；

2. 自主研发RIP试剂盒，畅销国内市场，效果有保证。

客户提供

1. 新鲜细胞/组织样本（组织≥100mg，细胞不少于1E+7个），细胞须保证无支原体污染；

2. IP级别抗体和抗体信息；

3. qPCR检测基因信息：物种、基因名称、长度和序列等，指定具体转录本（例如NCBI编号NM_001126113.2）；

4. RIP产物的其他检测项目（RIP-seq或者IP蛋白样本质谱）。

我们提供

1. RIP实验报告（方法、流程，结果）；

2. RIP剩余产物。

案例1

参考文献：

Bai D, Zhao J, Wang R, Du J, Zhou C, Gu C, Wang Y, Zhang L, Zhao Y, Lu N. Eubacterium coprostanoligenes alleviates chemotherapy-induced intestinal mucositis by enhancing intestinal mucus barrier. Acta Pharm Sin B. 2024 Apr;14(4):1677-1692. doi: 10.1016/j.apsb.2023.12.015. Epub 2023 Dec 30. PMID: 38572095; PMCID: PMC10985029.

案例2

参考文献：

Xu L, Ma X, Zhang X, Zhang C, Zhang Y, Gong S, Wu N, Zhang P, Feng X, Guo J, Zhao M, Ren Z, Zhang P. hsa_circ_0007919 induces LIG1 transcription by binding to FOXA1/TET1 to enhance the DNA damage response and promote gemcitabine resistance in pancreatic ductal adenocarcinoma. Mol Cancer. 2023 Dec 4;22(1):195. doi: 10.1186/s12943-023-01887-8. Erratum in: Mol Cancer. 2024 Jan 16;23(1):16. PMID: 38044421; PMCID: PMC10694898.

以anti-SNRNP70为目的抗体，anti-IgG为对照抗体，在Hela细胞裂解样本中，进行免疫沉淀。免疫沉淀所得蛋白质样品，进行Western blot检测，Input样本与目的样本在约70KDa大小位置有明显条带，阴性对照样本无条带。

免疫沉淀所得RNA逆转成cDNA后，以U1 snRNA特异性引物，进行qPCR分析，RIP组相对表达显著高于IgG组，指示SNRNP70富集U1 snRNA。

Western blot检测SNRNP70：

qPCR检测U1 snRNA：

1. RIP送样里细胞需要量是1E7的细胞量，是必须要达到1✖10的7次方的细胞量吗？

我们推荐用7次方进行，这种内源结合本来就只能结合少量的蛋白和RNA，如果最开始的细胞量少，结合下来的物质可能会更少。

2.RIP实验产物能否进行去线性，进行circRNA建库？

如果客户RIP捕获前已经打断了RNA，这直接可以判断，不能去线性

如果捕获产物中RNA的片段化程度比较高，不建议用去线性的方法测circRNA。

一般RIP测序，都是建议用去rRNA链特异的方面进行建库测序。

3.RIP结果WB检测正常，Input、IP、Igg三组ct值几乎无差异说明什么？

说明目的蛋白与检测基因无特异性结合。

4.为什么RIP实验前要做WB预实验评估？

做WB预实验主要目的：

①　检测抗体的特异性，是否能结合目的蛋白；

②　检测样本中目的蛋白是否有表达及丰度水平；

③　总之，检测该样本能否满足做RIP实验的最基本条件。

④　RIP预实验做的是WB检测，跟我们平常理解的预实验不太一样，这是探索性实验，预实验的目的是检测这个实验的基本条件。

5. 我的抗体做WB都有目的蛋白条带的，为啥做RIP就没条带了？

免疫试验有很多，但实验目的不一样，例如WB、ELISA、IP、IF、ChIP、IHC(P)、FACS，其中只有WB是一种需要将蛋白质变性的实验，用强烈的蛋白变性剂SDS和β巯基乙醇，将蛋白质的三维结构全部抹去，这种情况下任何一种该蛋白的抗体都能识别WB实验中变成直线状态的抗原；但能做WB的抗体就不一定能用来做非变性试验IP、IF、IHC了，因为天然蛋白的三维结构隐藏了很多抗体结合位点，WB级别的抗体无法与之结合。做RIP实验，需要选购IP级别的抗体。

6. 在RIP实验中，为什么IP和WB使用的抗体需要来源于不同的种属？

在RIP实验中，IP和WB使用的抗体需要来源于不同的种属，否者在跑WB时，会在55KD和25KD的位置出现较强的重链和轻链，影响目的蛋白的曝光。