IF39.3！circMPP6还能调控MEX3A和PBs蛋白互作？促癌机制新发现！

研究团队使用cBioPortal数据库分析，结合qPCR/WB/IHC对临床样本的检测结果，发现与癌旁组织相比，CRC中MEX3A的表达显著升高。SYSUCC队列显示，CRCs中高表达的MEX3A与临床分期及T、N分期呈正相关，并预示较差的患者总生存期(OS)。这表明，MEX3A的上调在CRC发病机制中具有致癌作用。（图1）

图1. MEX3A在CRC中高表达，抑制CRC细胞的自噬。

研究团队构建MEX3A敲低和过表达结直肠癌稳转细胞株进行实验：体外实验和在体内皮下成瘤实验表明，MEX3A加速了CRC的进展。（图1）

RIP-Seq和KEGG通路分析结果表明，自噬在MEX3A介导的CRC进展中发挥重要作用。（图2）

在血清饥饿时，敲低或过表达MEX3A，检测LC3-II和p62的丰度，结合mRFP-GFP-LC3和透射电镜（TEM）检测，结果表明MEX3A抑制自噬，从而促进结直肠癌的进展。（图2）

研究团队通过构建MEX3A全长序列和两个内在无序区(IDRs)截短突变质粒发现：截短IDRs，液滴大小和数量显著增加；而与全长MEX3A相比，删除IDRs使液滴难以观察到；相分离依赖于温度、蛋白质和盐浓度。（图2）

异位表达EGFP-MEX3A和光脱色荧光恢复(FRAP)实验结果表明，MEX3A的IDRs在CRC肿瘤发生中的LLPS和功能是必需的。（图2）

研究中co-IP和IF实验结果支持了MEX3A蛋白是PBs的一个组成部分。（图2）

图2. MEX3A经历idrs依赖的LLPS，并与PBs组分物理相互作用。

研究通过RIP/RNA-Seq/CircInteractome数据库分析/RT-PCR/Sanger测序/RNase R/放线菌素D实验验证了MOV10结合的circ_0001686（circMPP6）；核质分离和FISH实验显示，circMPP6主要定位于细胞质中，呈点状分别。（图3）

研究团队检测了30组结直肠癌组织中circMPP6的表达，发现circMPP6在结直肠癌组织中显著升高。RIP和RNA Pull-down实验证实circMPP6与PBs的核心成分MEX3A和MOV10相互作用。IF-RNA FISH检测发现MEX3A、MOV10和circMPP6在生理条件下在胞质共定位，嘌呤霉素加速circMPP6和MEX3A蛋白向细胞质灶的募集。克隆形成和Transwell迁移实验表明，circMPP6过表达增加了CRC细胞的增殖和迁移能力。在皮下异种移植模型中，circMPP6过表达显著增强了CRC的致瘤性并促进肿瘤生长。这些结果揭示了MEX3A/circMPP6复合物的形成，并表明了MEX3A/circMPP6复合物与CRC细胞中PBs的形成之间的密切关系。（图3）

图3. MEX3A与circMPP6在PBs中形成复合物。

WB结果显示circMPP6敲低不影响MEX3A的表达；敲除MEX3A和/或circMPP6后，PBs组分的表达不受影响。IF-RNA FISH检测显示，在嘌呤霉素预处理条件下，缺乏MEX3A和/或circMPP6诱导P小体解离；Co-IP实验结果显示，沉默或RNase A处理circMPP6降低MEX3A免疫沉淀组分中PBs相关蛋白的丰度；蔗糖梯度沉降分离结果表明，MEX3A与PBs蛋白组分的积累依赖于circMPP6。（图4）

该研究通过单独截断异构核核糖核蛋白K同源(KH)结构域，构建了MEX3A突变体。RIP和Co-IP实验结果表明，与circMPP6结合的MEX3A KH2结构域是招募PBs组分所必需的。（图4）

挽救实验显示外源表达的MEX3A野生型(WT)，明显逆转沉默MEX3A的促自噬及抑制增殖和转移的作用。这些结果强调了KH2结构域在MEX3A介导的结直肠癌侵袭性中的关键作用。（图4）

作者通过RIP-Seq/RNA Pull-down/RNA- EMSA实验/表型分析证实了CACU基序在circMPP6与MEX3A相互作用中的重要作用及其在CRC发病机制中的功能。这些研究结果表明circMPP6通过影响MEX3A-PBs组分的协作促进PBs聚集和维持。该研究首次阐述了RBP/circRNA复合物与PBs之间的联系。（图5）

图4. circMPP6通过加强MEX3A-PBs组分的相互作用促进PBs聚集。

通过对照或敲除MEX3A的DLD-1细胞mRNA-Seq/RIP/RNA Pull-down实验发现PDE5A, SENP7和TTLL7 mRNA受到MEX3A的调控和结合，PBs结构组分MOV10和UPF1表现出招募mRNA的能力。MEX3A/circMPP6敲低后，CRC细胞中PDE5A、SENP7和TTLL7 mRNA的稳定性显著增强。这些结果表明，MEX3A/circMPP6复合物介导的PBs聚集影响mRNA的降解。在MEX3A/circMPP6缺失后，PDE5A蛋白也增加，PDE5A被确定为MEX3A的潜在靶点。（图5）

通过RIP实验，发现MEX3A/ circMPP6敲低显著降低了PDE5A与UPF1的mrna结合能力。IF-RNA FISH检测显示，PDE5A mRNA与UPF1在细胞质中共定位。嘌呤霉素处理降低了PDE5A mRNA的荧光强度。缺乏MEX3A/circMPP6时，UPF1/PDE5A复合物的共定位降低，PDE5A mRNA的荧光强度增加。这些发现PDE5A和UPF1之间MEX3A/circMPP6复合物依赖性相互作用的积累增强了PDE5A mRNA的降解。（图5）

图5. MEX3A/circMPP6复合物促进PDE5A mRNA降解，并通过PDE5A途径调节CRC自噬。

挽救实验结果表明PDE5A的抑制明显抑制CRC自噬，逆转沉默MEX3A的促自噬作用，显著逆转了MEX3A沉默的对CRC细胞增殖和转移的抑制作用。裸鼠成瘤模型表明，体内PDE5A抑制剂能逆转MEX3A敲低细胞导致的致瘤性降低。裸鼠皮下注射MEX3A敲低或过表达的结直肠癌细胞，检测PDE5A表达发现MEX3A在结直肠癌中的致癌作用依赖于PDE5A通路。（图5）

研究通过TCGA、SYSUCC数据库分析，以及RNA-FISH和IF实验对临床样本的检测，发现PDE5A与MEX3A和circMPP6的表达水平呈负相关。KaplanMeier生存分析表明，高MEX3A和低PDE5A的CRC患者的OS最差。这些结果支持MEX3A上调可显著减弱PDE5A的表达，从而在结直肠癌侵袭性和患者预后中发挥关键作用。（图6）

图6. MEX3A/circMPP6-PDE5A轴在临床上与结直肠癌进展相关。