针对circRNA的接头序列设计siRNA序列特异性敲低目的circRNA的表达,对于每条选定的siRNA靶序列,设计正义链和反义链,以 loop(9nt or 10nt)相连,构建shRNA质粒直接转染或通过病毒包装后转染细胞,并对转染细胞进行阳性鉴定和转代细胞株的培养,最终实现对特定circRNA特异性敲低的作用。
针对circRNA circPAIP2进行siRNA敲低实验示意图
技术优势
1. shRNA载体转染效率高、操作简单、RNA沉默效果易于检测;
2. 设计circRNA Divergent primers检测敲低circRNA的效率;
3. 特异性敲低circRNA的表达,不影响亲本线性基因的表达。
客户提供
1. mRNA/lncRNA需要提供基因名称(ID号)、种属;
2. circRNA需要提供基因名称(ID号)或者完整序列、种属。
交付标准
1. shRNA质粒(3+1套餐,3个无敲低效果,免费加做一个):10 μg质粒+200 μL甘油菌;
2. 对照质粒:10 μg质粒+200 μL甘油菌;
3. 载体构建报告;
4. 筛选验证报告(细胞转染+qPCR检测)。
qPCR检测结果
表1 NNN细胞中has_circ_000XXXX相对表达差异
图1 NNN细胞中has_circ_000XXXX相对表达差异
1. circRNA 的沉默(干扰)怎么做?
基于RNAi技术对基因进行沉默,实验中一般设计合成靶标基因的siRNA,瞬转细胞后进行RT-PCR检测。
外显子来源的circRNA因为和mRNA有同样的外显子序列,在序列内部设计siRNA靶标无法保证特异性,因此只能针对junction位点处设计靶标序列,前后移动范围有限,siRNA通常很难设计。EiciRNA或者内含子来源的环形RNA,除了针对junction位点处设计靶标外,也可以尝试在内含子序列上设计。
2. 设计siRNA为什么不能连续G\C超过3个,连续A\T超过4个?
因为连续 3个以上的 G 和 C 可以降低双链 RNA 的内在稳定性,从而抑制 RNAi 作用;连续 4个以上的 U 和 A 可能终止由 RNA Polymerase III 介导的转录。siRNA 序列中的重复序列或回文结构可能形成发夹状结构,这种结构的存在可以降低 siRNA 的有效浓度和沉默效率。