circRNA翻译验证载体示意图

T1： circRNA-OE（circRNA过表达载体）

使用吉赛生物专利技术的第五代circRNA过表达载体进行构建，利用载体携带的侧翼成环框架（IR）使插入的circRNA序列准确剪切成环表达。包含细胞转染和qRT-PCR检测，保证插入的circRNA序列准确剪切成环过表达。

T2：circRNA-3xFlag（含3xFlag标签的circRNA过表达载体）

在circRNA-OE载体的基础上，于预测ORF的终止密码子前添加3xFlag标签序列，利用载体携带的侧翼成环框架（IR）使插入的含3xFlag标签的circRNA序列准确剪切成环表达。包含细胞转染和qRT-PCR检测，保证插入的circRNA序列准确剪切成环过表达。

T3：circRNA-3xFlag-△ATG（含3xFlag标签并突变ATG的circRNA过表达载体）

在circRNA-3xFlag载体的基础上，突变预测ORF的起始密码子ATG，利用载体携带的侧翼成环框架（IR）使插入的含3xFlag标签的circRNA序列准确剪切成环表达。

T4：circRNA-3xFlag-NC（含3xFlag标签并删除下游IR的载体，即不能成环的阴性对照）

在circRNA-3xFlag载体的基础上，删除载体下游的成环框架（IR），使能转录生成与circRNA-3xFlag相同的RNA序列但不剪切成环。该载体可作为阴性对照使用。

T5：circRNA-3xFlag-**aa（预测ORF的线性表达载体，即**aa的阳性对照）

使用与吉赛生物专利技术的第五代circRNA过表达载体相同骨架（不含成环框架）的载体进行构建，插入预测的ORF全长，使能转录生成线性化的ORF全长序列，并能正常翻译生成预测的多肽**aa。该载体可作为阳性对照使用。

客户提供

1. 指定载体名称；

2. circRNA名称（ID）、物种&已预测的ORF序列信息。

交付标准

每个载体提供10 μg质粒，200 μL甘油菌。

案例1：

南京中医药大学的顾春艳教授和杨烨教授，海军医科大学的杜鹃主任医师，在Journal of Experimental & Clinical Cancer Research联合发表文章A novel protein encoded by circHNRNPU promotes multiple myeloma progression by regulating the bone marrow microenvironment and alternative splicing，研究结果表明，circHNRNPU_603aa在MM细胞和BM中都是一种很有前途的诊断和治疗标记物。

在本文研究中，作者分别对circHNRNPU_603aa的内源和外源表达进行了验证。如图1E所示，使用吉赛生物的翻译载体系统，对circHNRNPU_603aa的外源表达进行细胞内验证。功能实验发现，过表达circhRNPU可以促进骨髓瘤细胞的功能，而针对特定肽段敲低的siRNA可以抑制骨髓瘤细胞的功能。既circHNRNPU_603aa促进MM发展的作用，并进行成瘤实验验证了它的这种功能。

图1. CirchRNPU编码一种新的HRNPU亚型

案例2：

金哲教授（深圳大学），秦颖副主任医师（深圳市第二人民医院）和Song Li（深圳市科技发展交流中心）共同通讯在Mol Cancer发表文章A novel protein AXIN1-295aa encoded by circAXIN1 activates the Wnt/β-catenin signaling pathway to promote gastric cancer progression。研究发现，相比于相邻正常胃组织，circAXIN1在GC组织中高表达。CircAXIN1编码一种295个氨基酸（aa）的新蛋白质，命名为AXIN1-295aa。

本文研究中，作者对五对GC样本进行高通量测序，差异表达的circAXIN1被提示编码一种新的蛋白质。CircAXIN1编码一种新的蛋白质AXIN1-295aa。如图1所示，作者分别使用在过表达载体中插入Flag标签以及插入EMCV IRES序列的Luc2报告载体两种方式，验证了circAXIN1的翻译。（T系列和R系列circRNA翻译验证载体由广州吉赛生物提供）。

图1. CircAXIN1编码AXIN1-295aa的验证

参考文献：

1. A novel protein encoded by circHNRNPU promotes multiple myeloma progression by regulating the bone marrow microenvironment and alternative splicing J Exp Clin Cancer Res. 2022 Mar 8;41(1):85.

2. A novel protein AXIN1-295aa encoded by circAXIN1 activates the Wnt/β-catenin signaling pathway to promote gastric cancer progression. Mol Cancer .2021 Dec 4;20(1):158.

过表达载体构建及鉴定：

以PCR扩增hsa_circ_00AAAA-3xFlag的全长***bp序列，In-Fusion克隆连接到pLC5-ciR中。

图1 pLC5-ciR载体图谱

载体测序引物：pC5-seqF: TGTGAATTTGACCCTTAAGA

                         pC5-seqR: TCCTCTCTTGATTTCCTTATT

测序峰图正常，无杂峰或叠带，序列对比吻合，表明hsa_circ_00AAAA-3xFlag成功插入pLC5-ciR中，过表达载体构建成功

qPCR验证转染后表达效率：

qPCR产物测序结果：

注：hsa_circ_00AAAA在circBase中的环化位点序列NNNNAGNNNN

结论：

相比于对照组，CAAAAA组的过表达倍数为***；PCR产物测序峰图正常，无杂峰或叠带，序列与环化位点参考序列对比吻合。以上结果表明CAAAAA能在真核细胞中成功过表达目的hsa_circ_00AAAAA。