RNA pull-down是检测RNA结合蛋白与其靶RNA之间相互作用的主要实验手段之一。目前常用的两类技术，线性RNA替代法与探针钓取法，对同源性较高或表达丰度较低的circRNA并不适用。吉赛生物新一代circRNA pull-down技术，可对大部分circRNA实现高效率、强特异性的捕获。

circRNA pull-down技术原理

实验流程

circRNA pull-down实验流程

实验分组

circRNA pull-down实验分组

技术优势

1. 实验体系捕获的是环形的circRNA分子，相对“线性RNA替代法”可信度更高；

2. 通过circRNA过表达载体引入外源标签，可降低来源基因的背景干扰；

3. circRNA标签与捕获蛋白间的相互作用远远强于探针分子的捕获作用，特异性更高；

4. circRNA标签的插入位置可灵活设计，能有效避免竞争性探针导致的junction位置互作分子信息丢失问题；

5. 不依赖于细胞内本底表达的circRNA量，对细胞内表达丰度低的circRNA同样适用。

客户提供

1. circRNA名称（ID）、长度、序列、物种；

2. 指定载体名称；

3. 实验目的；

4. 预测结合位点信息；

5. 细胞和细胞相关信息。

交付标准

1. 详细的circRNA pull-down完整实验报告（包含载体构建、诱导表达、pull-down富集等）；

2. 带标签过表达质粒、不带标签过表达质粒、对照质粒（赠送）等；

3. 额外赠送（以下情况任选一）：

①　质谱检测2个样本；

②　pulldown产物2个以内WB检测；

③　pulldown产物3个以内miRNA qPCR检测。

1、circRNA pull-down技术在circRNA与蛋白间相互作用研究中的应用

在2016年Nature Communication杂志上发表了一篇关于circANRIL在动脉粥样硬化这一疾病中功能研究的文章中[1]，作者使用了RNA标签BoxB对circANRIL进行了标记，在工具细胞293T中进行pull-down实验。

作者对pull-down获得的蛋白进行质谱分析，结果显示，circANRIL结合蛋白中有38%与核糖体的形成有关，16%的蛋白参与了细胞内RNA的剪切调控[1] 。

这一结果为作者的后续研究提供了重要的指示，预测circANRIL与核糖体RNA形成可能存在密切关系，同时也是一个强有力的证据。

circANRIL pull-down获得的蛋白质谱分析[1]

2、circRNA pull-down技术在circRNA与miRNA间相互作用研究中的应用

2017年Journal of Experimental & Clinical Cancer Research杂志上发表的文章中，作者使用了MS2序列作为circRNA标签，在不同的乳腺癌肿瘤细胞中研究circRNA sponge功能。

作者在circGFRA1中引入了MS2序列标签，分别在MDA-MB-231、MDA-MB-486和BT549 这3株三阴性乳腺癌细胞中进行了pull-down，对circGFRA1进行富集，发现在circGFRA1富集产物中miR-34a也存在明显的富集情况[2]。随后一系列的实验结果证明，circGFRA1通过吸附miR-34a对其下游基因的表达进行调控，从而实现对肿瘤细胞增殖的促进作用。

circGFRA1富集产物中与miR-34a也存在明显的富集情况[2]

参考文献

1. Holdt, L.M., et al., Circular non-coding RNA ANRIL modulates ribosomal RNA maturation and atherosclerosis in humans. Nat Commun, 2016. 7; 12429.

2. He, R., et al., circGFRA1 and GFRA1 act as ceRNAs in triple negative breast cancer by regulating miR-34a. J Exp Clin Cancer Res, 2017.10;36(1): 145.

3. Jian X, He H, Zhu J, et al. Hsa_circ_001680 affects the proliferation and migration of CRC and mediates its chemoresistance by regulating BMI1 through miR-340. Mol Cancer. 2020 01;19(1):20.

通过pull-down实验将MS2-CP-MS2-circRNA复合物拉下来，WB检测MS2-CP蛋白，RT-qPCR检测目的circRNA的富集程度。

pull-down样品分组

WB检测结果

图1 pull-down 前后样本WB检测结果（Flag抗体）

1~8组分别对应pull-down实验分组样品编号

RT-qPCR验证pull-down富集效果

qPCR产物检测hsa_circ_00AAAAA富集倍数

图2 pull-down产物检测hsa_circ_00AAAAA富集倍数

1~8组分别对应pull-down实验分组样品编号