吉赛ONT三代测序助力circRNA新研究！肖礼祖/唐七义/朱桦团队全面表征水痘带状疱疹病毒circRNA并揭示其生物学功能

作者：EP

校稿：杨少敏

水痘带状疱疹病毒(Varicella-zoster virus, VZV) 是一种双链DNA病毒，属于α疱疹病毒家族；是引起水痘(Varicella)和带状疱疹(Herpes zoster, HZ)的病原体。VZV初次感染人体的症状为躯干、头部或面部出现水泡性瘙痒皮疹，称为水痘(Varicella)(1)，常见于10岁以下儿童，发生率约为1.40亿(2, 3)。VZV可在神经节神经元中建立潜伏期，再激活的VZV大量复制并沿感觉神经纤维向所支配的皮节扩散引起水痘(Varicella)皮疹，称为带状疱疹(Herpes zoster，HZ)(4, 5)。VZV病毒基因组大小约为124kp，传统认为其大约编码71个开放阅读框(Open Reading Frame, ORFs)(6)，即基因。在VZV激活阶段(即裂解性感染，Lytic infection)，71个ORFs均可转录大量病毒RNA。但在潜伏期间，VZV基因组DNA为环状结构；且几乎所有基因均处于静息状态，仅在ORF61附近表达VZV潜伏相关转录本(VZV latency-associated transcript, VLT) (7)。

最近研究利用先进的测序技术，如第二代短读测序和牛津纳米孔技术(ONT)长读测序，揭示了VZV感染细胞中复杂的转录组，并鉴定了许多非编码RNAs的非规范ORF(8)。该转录组包含以前未发现的转录本、各种转录异构体和值得进一步研究的剪接事件。

环状RNA (circRNA)是通过反剪接共价结合单链RNA形成的。circRNA缺乏5’帽结构和3’poly（A）尾的独特环状结构，使其比线性RNAs更耐受核酸外切酶，如RNase R。传统的circRNA分析方法需要从用RNase R处理总RNA ，然后通过短读RNA-seq，从数据中识别出反向剪接(BSJs)。最新的测序技术，尤其是结合RNase R处理和滚环反转录的ONT长读测序技术，为深入识别全长circRNA提供了更可靠的工具。在多种DNA和RNA病毒感染的细胞中已鉴定出病毒环状RNA。

华中科技大学协和深圳医院(深圳市南山区人民医院)疼痛科是国家临床重点专科疼痛科，2023年获评复旦大学医院管理所2022年度专科综合排行榜全国综合排名第三名，同时该科室拥有深圳市慢性疼痛重点实验室。自2014年建立以来以解决带状疱疹性神经痛临床问题为目标，开展多维度不同层次的研究。带状疱疹神经痛该院疼痛科的神经病理性疼痛的核心病种，每年约250～300例HZ或PHN住院患者在此得到规范治疗。

2024年6月10日， Nature Communications（IF=16.6）在线发表由华中科技大学协和深圳医院，联合美国罗格斯大学新泽西医学院和美国霍华德大学的研究性论文“Identification and Characterization of Varicella Zoster Virus Circular RNA in Lytic Infection”。博士后杨少敏（该院），实验员曹迪（该院）和Dabbu Kumar Jaijyan（罗格斯大学）为共同第一作者；唐七义教授（霍华德大学），肖礼祖主任（该院）和朱桦教授（罗格斯大学）为共同通讯作者。该研究采用二代短读测序和三代ONT长读测序鉴定和表征了VZV感染的神经母细胞瘤细胞和VZV中的环状RNA，鉴定了一种源自VZV潜伏期相关转录本(VLT)的VZV circRNA，并命名为circVLTSlytic，研究结果表明circVLTSlytic赋予了VZV对阿昔洛韦（ACV）的耐药性，揭示了VZV逃避抗病毒治疗的潜在机制。

VZV感染期间宿主环状RNA的动态

研究采用荧光检测/RT-qPCR/WB检测病毒相关指标；通过深度circRNA-seq鉴定细胞circRNA，并存入circBank（吉赛生物生信部联合加拿大多伦多大学创建的公开circRNA专业数据库，网址：http://www.circbank.cn/）。利用DESeq2/GO/KEGG等生信分析，发现大多数细胞circRNA的产生不受VZV感染的影响，VZV调控的细胞DE-circRNAs亲本基因与细胞生长调控、染色体分离、纺锤体、GTPase调节活性、核苷-三磷酸酶调节活性信号通路、轴突导向甲状腺激素信号通路有关。研究选择了VZV调控的6个重要的细胞DE-circRNA，并进行了Sanger测序和qPCR验证。

图1. VZV感染期间细胞circRNA的概况。

VZV编码circRNA的算法鉴定和表征

研究采用BGISEQ短读测序和ONT长读测序全面鉴定了VZV编码的circRNA，结果表明病毒circRNA随VZV感染时间而增加；较长的circRNA表达水平较低。短读测序具有高通量的优势，CIRI-full重建了42,563个人类全长circRNA，和其它部分组装的circRNA；而长读测序鉴定出12,407个全长人类全长circRNA；短读测序鉴定出71个全长VZV circRNA，而长读测序鉴定出1358个全长VZV circRNA，这体现了ONT滚环长读序列检测病毒circRNA中更高的效率和可靠性。进一步分析发现，大部分的VZV和细胞circRNA都含有多个环状外显子；VZV circRNA平均长度比细胞的短；VZV circRNA表现出大约50%的链偏好；VZV circRNA有多种异构体，如与潜伏期相关转录本（VLTs）同源的circVLTSlytic。

研究中ONT circRNA长读测序（Nanopore circRNA全长测序）由吉赛生物提供。Nanopore circRNA全长测序是利用随机引物对RNase R富集后的circRNA进行滚环反转录扩增，采用纳米孔测序技术对circRNA的全长序列进行直接测序，并使用特定算法，实现对长测序片段中的circRNA序列进行识别和全长重构。上述研究对比了二代与三代ONT测序技术，二代测序通量更高，但三代ONT测序在针对丰度更低的VZV circRNA的检测更灵敏。

三代ONT测序技术在检测circRNA上具有极大优势：

1. 更强的检出率：相比二代测序，纳米孔测序可以将circRNA reads检测效率提高20倍以上。

2. 更高的灵敏度：可识别低丰度的circRNA，能够更敏感地捕获到非经典circRNA，i.e., intronic。

3. 更多更准确的应用领域：

1）准确识别可变剪切事件，无需拼接，一键生成；

2）直接识别癌症等重大疾病发生发展的重要生物标志物一一融合环状RNA(f-circRNA)；

3）能够更敏感的识别研究热点一一线粒体环状RNA，确保您的研究不会落空。

图2. VZV circRNA的鉴定及表征。

图3. VZV circRNA和circVLTSlytic全长。

VZV感染细胞中病毒circRNA的实验鉴定

研究通过RT-PCR、Sanger测序、RNase R敏感性试验和该团队发明的链式扩增FISH技术鉴定了测序得到表达量较高的VZV circRNA，结果表明这些病毒circRNA存在于VZV感染细胞中，circVLTSlytic含多个外显子，主要分布于VZV感染细胞的细胞核和细胞质。

研究中RNase R（GSPure®RNase R）由吉赛生物提供，RNase R是一种来源于大肠杆菌RNR超家族的3’-5’核糖核酸外切酶，可从3’-5’方向将RNA逐步切割成二核苷酸和三核苷酸。RNase R可消化几乎所有的线性RNA分子，但不易消化环形RNA、套索结构或3’突出末端少于7个核苷酸的双链RNA分子。RNase R是circRNA的鉴定和富集实验必备工具酶，可消化线性RNA以使环形RNA（circRNAs）或套索结构RNA（lariat RNA）得到富集。RNase R广泛应用于circRNA鉴定（如上述的RNase R敏感性试验）、富集（如上述的测序分析）、纯化（如circRNA制备）等。

图4. VZV环状RNA的实验鉴定。

带状疱疹（HZ）患者组织和临床毒株中VZV circRNA的鉴定

研究收集6名被诊断为带状疱疹（HZ）患者的水泡液和分离的VZV毒株样本，经过RT-PCR和Sanger测序证明HZ患者水泡液和临床VZV毒株感染中都存在VZV circRNA，其中circVLTSlytic在以上两种样本中都存在。

图5. HZ患者中VZV circRNA的鉴定。

circVLTs的DNA侧翼5’剪接供体是VZV circVLTSlytic形成的一个顺式元件

分析circVLTSlytic在基因组的位置发现，只有五号外显子不与VZV经典基因（ORF）发生重叠。因此，该团队利用细菌人工染色体(BAC)系统在pOka株（该病毒株已经插入了GFP和luciferase双报告基因）基因组DNA水平进行20个随机碱基替换突变，并产生pOka-M1（5’剪接供体下游突变）和pOka-M2（5’剪接供体上游突变）突变VZV株。结合RNA-seq和qPCR检测，结果表明，circVLTSlytic外显子5突变轻微抑制了RNA转录，且外显子5与外显子1有相互作用；DNA侧翼5’剪接供体附近序列对VZV circVLTSlytic剪接形成起关键作用，是VZV感染细胞后circVLTSlytic生物发生和表达所必须的顺式作用元件。

图6. circVLTSlytic基因组水平突变

circVLTSlytic外显子5的突变使VZV对阿昔洛韦更敏感

团队通过荧光素酶报告基因检测发现circVLTSlytic外显子5突变不影响VZV的生长；但用IFN-β、ACV或RDT三种抗病毒药物处理感染细胞给予VZV生长压力，发现pOka-M1对ACV的敏感性增加；补救实验（慢病毒载体过表达circVLT两种亚型）以及体外培养的人类皮肤、背根神经节以及人皮肤组织移植小鼠模型，并用ACV治疗，结果表明， circVLTSlytic是VZV复制的非必须分子，但其存在有助于VZV抵抗抗病毒药物的作用。进一步的研究表明，circVLTSlytic可能通过调控VZV基因的表达，从而响应抗病毒治疗。

研究中circRNA慢病毒过表达载体（pLCDH-ciR）由吉赛生物提供，吉赛生物第五代circRNA过表达载体系列能满足普通真核表达、慢病毒包装和腺相关病毒（AAV）包装等多种用途。载体均携带优化过的侧翼成环框架，含有精心改造的Alu元件、QKI等RBP的结合位点，并使用全新设计的环化介导序列，能保证插入的circRNA准确高效环化。吉赛生物第五代circRNA过表达载体环化具有更高的准确性、稳定性、通用性、可移植性。

图7. circVLTSlytic外显子5的突变不会减弱VZV的复制，但会提高对ACV敏感性。

总结

该研究利用二代和三代测序技术以及生信分析鉴定及表征了VZV编码的circRNA，并在HZ患者感染细胞和组织中验证了这些circRNA的存在，报道一些新发现的VZV circRNA，还证明了circVLTSlytic 5'剪接供体下游序列的突变能增强VZV对阿昔洛韦敏感性，circVLTSlytic有利于VZV基因的表达，从而使VZV响应抗病毒治疗。这些结果证明VZV的感染过程中不止表达传统认知的71个ORFs，病毒来源的circRNA在VZV发病机制中可能发挥重要作用，揭示了circVLTSlytic在影响病毒耐药性中的潜在作用。

原文链接

https://www.nature.com/articles/s41467-024-49112-4

该文章相关代码和数据均已开源：https://github.com/ShaominYang/VZV_circRNA

参考文献

1. Gershon AA, Breuer J, Cohen JI, Cohrs RJ, Gershon MD, Gilden D, et al. Varicella zoster virus infection. Nat Rev Dis Primers. 2015;1:15016.

2. Thiele S, Borschewski A, Kuchler J, Bieberbach M, Voigt S, Ehlers B. Molecular analysis of varicella vaccines and varicella-zoster virus from vaccine-related skin lesions. Clin Vaccine Immunol. 2011;18(7):1058-66.

3. Varicella and herpes zoster vaccines: WHO position paper, June 2014--Recommendations. Vaccine. 2016;34(2):198-9.

4. 赵志奇. 带状疱疹痛:基础和临床概述. 中国疼痛医学杂志. 2014(6):369-75.

5. 带状疱疹后神经痛诊疗中国专家共识. 中国疼痛医学杂志. 2016;22(03):161-7.

6. Zhang Z, Selariu A, Warden C, Huang G, Huang Y, Zaccheus O, et al. Genome-wide mutagenesis reveals that ORF7 is a novel VZV skin-tropic factor. PLoS Pathog. 2010;6:e1000971.

7. Depledge DP, Ouwendijk WJD, Sadaoka T, Braspenning SE, Mori Y, Cohrs RJ, et al. A spliced latency-associated VZV transcript maps antisense to the viral transactivator gene 61. Nat Commun. 2018;9(1):1167.

8.  Braspenning, S. E. et al. Decoding the Architecture of the VaricellaZoster Virus Transcriptome. mBio 11 (2020). https://doi.org/10.1128/mBio.01568-20