规模化质粒测序犯难了吗？Nanopore三代技术：包在我身上！

质粒广泛应用于生物学领域，可进行基因克隆和表达、RNA和蛋白制备等，在医学领域也被应用于基因治疗和细胞治疗等研究开发。因此，对质粒序列进行精确验证及污染控制，对于生产高质量载体而言是十分必要的。

图1.质粒示意图

1.一代测序（Sanger法）局限性在于：

● 周期长、成本高：操作繁琐，需要合成多对引物，进行多个PCR扩增，拼接得到序列全长；

● 准确性低：难以准确对复杂序列或多聚体质粒进行测序；

● 通量低：无法一次性准确测出混合质粒或分析杂质DNA。

2.二代测序（NGS）局限性在于：

● 读长限制：二代测序（如Illumina）读长短（通常<300bp），依赖片段拼接，难以覆盖质粒全长结构。

● 无法检测复杂结构：难以解析重复序列、结构变异及低丰度污染（如质粒混合物中<1%的污染）。

● 依赖PCR扩增：引入扩增偏倚，可能掩盖真实序列变异。

Nanopore三代测序的核心原理是基于纳米孔传感技术与单分子实时电信号检测，在电泳驱动下将DNA/RNA单链牵引穿过嵌于抗性膜的蛋白纳米孔，不同碱基/修饰碱基通过孔道时引发特征性电流信号，经高灵敏度芯片实时捕获电流变化，结合机器学习算法将电信号转换为碱基序列。

该技术无需扩增或打断序列，可直接读取完整DNA分子，具有读长长、准确性高、操作简便、测序周期短等优势。

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图2. Nanopore三代测序过程^[1]

1.高效快速

● 无需前期引物设计，单次测序24小时内完成，最大可覆盖50kb全长序列。

2.精准可靠

● 基于ONT平台实现Q28级质量值（原始准确率97%-99.9%）。

3.复杂样本突破

● 长读长技术可攻克高GC含量、大片段重复、发夹结构等难题；

● 无质粒尺寸限制，成功解析AAV2 ITR、长重复序列等特殊模板。

4.操作智能化

● 超低样本需求：DNA起始量100ng；

● 全盲测序能力：无需预知序列信息或设计特异性引物；

● 高通量经济性：批量样本测序成本较传统方法显著降低。

在药物开发等领域，质粒作为关键原材料/中间体，其质量控制（序列准确性、杂质污染等）决定药物生产成败。全质粒测序可精准检测骨架缺失、重组等样本问题，是验证质粒结构的高效手段，商用或实验室传代质粒均可通过该检测预先排查骨架风险，保障后续研究与生产。

1、为何需要进行质粒全长测序?

● 完整性核验：克隆扩增过程中可能引发自发突变（如碱基缺失/插入）或表观遗传修饰，全长测序可精准捕获异常位点；
● 质控标准化：通过序列比对验证插入片段方向、拷贝数及连接位点，排除非预期突变，确保基因工程系统可靠性；
● 实验设计赋能：明确载体酶切位点分布、抗性基因框架等关键信息，为引物设计、载体改造提供精准数据支持

2、测序结果的准确性如何?

目前的碱基准确性大于95%，并且可通过一致性序列进行矫正，矫正后的准确率可达99.9%。

3、测序失败的原因有哪些?

● 未按照要求用Qubit检测浓度；

● 存在基因组和质粒的片段、其他质粒杂质，存在质粒降解的现象。

因此建议送样前确定样本是否达标。

[1] https://nanoporetech.com/platform/technology