环状RNA：肺癌疗法开发的新突破口

从外泌体入手可挖掘更多潜在靶点。外泌体是由细胞分泌的胞外囊泡，大小在40-160 nm之间，其大小、内容物、功能和起源各异。外泌体可以转运大量的miRNA、环状RNA（circRNA）和其他核酸、膜蛋白和小分子。当从细胞表面释放时，外泌体与质膜融合受体细胞，促进其内容物进入细胞质的运输。与非恶性细胞相比，癌细胞可以产生更多数量的外泌体。

图1 外泌体在肺癌病理中的作用^[4]

多种circRNA被包裹在外泌体内，进行细胞间转运。具有表观调控作用的外泌体circRNA，由细胞外囊泡促进其进入肿瘤细胞，发挥促癌或抑癌功能，有望成为新的靶向治疗靶点。

图2 外泌体circRNA在NSCLC中的功能^[5]。

复旦大学附属肿瘤医院唐爽、宋少莉教授团队发现肺癌细胞缺氧诱导产生的外泌体circPLEKHM1，通过将巨噬细胞极化为M2型，驱动NSCLC转移。外泌体circPLEKHM1进入巨噬细胞后，促进了PABPC1-eIF4G的相互作用，从而促进了抑瘤素M受体（OSMR）的翻译，诱导巨噬细胞M2极化，加速了癌症的转移过程。团队利用ASO靶向circPLEKHM1治疗显著抑制了体内NSCLC转移，证明了外泌体circPLEKHM1可作为肺癌转移的治疗靶点^[6]。

靶点发现（缺氧条件下表达上调的circRNA）

● A549细胞低氧和常氧条件培养

● 外泌体分离与鉴定（TEM、NTA、WB）

● 外泌体circRNA-seq筛选表达差异circRNA

● circRNA结构验证（RNase R耐受性）

● circRNA表达验证（RT-qPCR）

转录调控研究（调控circPLEKHM1转录的因子）

● 相关转录因子（HIF1A）敲低

● ChIP-qPCR、双荧光素酶报告基因试验

功能验证（促进巨噬细胞极化和NSCLC转移）

体外

● circPLEKHM1干扰、过表达

● 外泌体提取、与细胞共培养

● Transwell、巨噬细胞极化检测

体内

● 小鼠全身转移模型构建

● 氯膦酸盐脂质体清除巨噬细胞

● 巨噬细胞M2标志物检测（SPECT/CT活体成像、RT-qPCR、流式细胞术、多重免疫荧光）

机制研究（诱导巨噬细胞M2极化的机制）

● circPLEKHM1过表达

● RNA-seq、生信分析

● OSMR敲减挽救实验

● RNA pulldown-MS鉴定RNA互作蛋白

● RIP验证蛋白-RNA互作

● Co-IP、IF验证蛋白互作

● Polysome profiling分析翻译调控作用

治疗潜力验证（靶向circPLEKHM1治疗效果）

● 心肌/胫骨注射转移模型构建

● circPLEKHM1-ASO给药

● 活体成像、Micro-CT

● TRAP染色、IHC

临床队列验证（在NSCLC患者中的临床意义）

● 110例NSCLC患者组织样本采集

● RT-qPCR

● Kaplan-Meier分析

癌症免疫疗法可利用免疫系统，靶向和消除癌细胞，是一种很有前途疗法。免疫检查点抑制剂（ICI）疗法是目前最常用免疫疗法，已被批准用于多种肿瘤的临床治疗。然而，由于肿瘤异质性和TME（肿瘤微环境）复杂性，仅解除免疫抑制可能无法恢复足够的抗肿瘤免疫，ICI单一疗法不足以控制肿瘤增殖。因此，需要增加T细胞或肿瘤杀伤细胞因子诱导抗肿瘤免疫。

circRNA具有编码和非编码的多功能性，结构固有的高稳定性、低免疫原性、快速生产、低成本等优势，可作为肺癌免疫疗法开发平台。

现有癌症疫苗多采用肌肉注射或静脉给药，易引发全身性炎症反应，且难以有效靶向肺部肿瘤。鼻腔黏膜是呼吸道的首道防线，支气管是90%肺癌起源部位，针对性的给药方式，特别是鼻内给药或气管内给药，可以提高药效和安全性：

①肿瘤源头局部激活免疫应答，可显著提升针对肺部病灶的治疗效果；

②避免药物肝首过代谢及在循环中的快速清除；

③避免药物在非靶组织中出现过高剂量的暴露，减小脱靶效应；

④有利于降低药物剂量，避免较高药物剂量或更频繁给药产生的耐药性。

清华大学林欣教授团队基于优化的LNP和编码SIINFEKL（OVA抗原表位肽）的circRNA，开发了全球首个鼻内给药的circRNA癌症疫苗。在肺癌模型小鼠中，该疫苗诱导了强大的抗肿瘤 T 细胞反应，精准清除肺部肿瘤；减轻了通常与静脉注射 mRNA疫苗相关的全身不良反应；还可调节 CAR-T细胞反应，增强对表达特定肿瘤相关抗原的肿瘤细胞的治疗效果^[7]。

图3 单细胞测序显示，疫苗治疗组CD4和CD8效应细胞和记忆细胞的数量和比例增加；Gzma和Gzmb的表达水平升高，表明CD8 T细胞的抗肿瘤功能显著增强。

多伦多大学李博文团队研究团队开发了编码IL-12的LNP-circRNA药物，并验证了肿瘤内注射和气管内给药方式，均有效缓解Lewis肺癌小鼠模型的肿瘤进展，ICI和癌症免疫治疗的联合治疗，可显著诱导肿瘤消退^[8]。

免疫原性细胞死亡（ICD）可使肿瘤更容易被免疫系统识别。ICD通过损失相关分子模式（DAMPs），即受损组织或死亡细胞释放的内源性分子，作为识别和攻击的危险信号，促进树突状细胞（DC）的成熟和呈递，最终导致肿瘤特异性T细胞介导的抗肿瘤免疫应答。

江苏省肿瘤医院许林、董高超、蒋峰团队研究在肺腺癌中发现了一种潜在的ICD诱导剂circRNA cEMSY，通过瘤内给药cEMSY-LNP，可使肺腺癌小鼠模型对anti-PD-1治疗显著增敏，具有开发增强癌症免疫治疗策略的潜力^[9]。

关键circRNA（cEMSY）筛选与鉴定

● 细胞ICD模型构建

● 全转录组测序+生信分析

cEMSY诱导ICD能力验证

● 体外过表达cEMSY，检测ICD标志物

● 体内过表达cEMSY，检测肿瘤生长和生存期

cEMSY-LNP联合PD-1阻断疗法体内验证

● circRNA合成与LNP包封

● 建立肺腺癌小鼠模型，瘤内给药

● 评估免疫记忆、肿瘤生长、生存期

cEMSY作用机制研究

● 转录组测序分析先天抗病毒免疫反应

● RNA pulldown检测互作蛋白

临床相关性分析

● 多重免疫荧光分析65例肺腺癌患者样本

● TCGA/GEO队列分析cEMSY与免疫细胞浸润、ICI响应率及生存预后的关系

图4 使用cEMSY-LNP和/或anti-PD-1治疗双侧荷瘤小鼠后，肿瘤体积变化。

利用circRNA编码CAR蛋白，可以构建瞬时CAR-T细胞，可特异性杀伤肺癌细胞，减轻传统基于病毒载体CAR-T方法的局限性，如复杂的过程和整合基因、长期表达带来的副作用。此外，利用优化的递送系统，将编码编码CAR蛋白的circRNA体内递送到T细胞中，还可实现更安全、便捷的体内CAR-T疗法。

DLL3是肺癌治疗的热门靶点。北京大学人民医院邱满堂、王俊联合南京医科大学附属医院孙明团队再次验证了DLL3在SCLC组织中高表达，在正常肺组织中表达极低。团队将编码anti-DLL3 CAR的circRNA递送到人类原代T细胞中，构建anti-DLL3 CAR-T细胞，通过尾静脉注射到小细胞肺癌小鼠模型中。与线性mRNA相比，基于circRNA的CAR-T细胞具有更强的肿瘤杀伤作用，可将人小细胞肺癌肿瘤完全消除^[10]。

图5 基于mRNA和circRNA构建的CAR-T治疗后小鼠模型的肿瘤体积和小鼠存活分析^[10]。